がん細胞の内部頸動脈注入による脳腫瘍転移のモデリング

要約

出典:Lim, M., et al.がん細胞の内部頸動脈注射による脳転移のモデリング。J. Vis. Exp.(2022年度)

このビデオでは、麻酔をかけたマウスが、がん細胞を総頸動脈(CCA)に注入して脳への標的送達を促進する外科的処置を受けています。この手順では、頸動脈を正確に縫合して操作し、注入された細胞を内頸動脈(ICA)に向け、時間の経過とともに脳内の腫瘍形成を促進します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1。注射用がん細胞の調製

注:この研究では、ヒト乳がん細胞株BT-474(BT474)を使用しました。BT474は、10%のウシ胎児血清と1%のインスリンを添加したRPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium)1640培地を含む完全な増殖培地で培養しました。細胞は、空気中雰囲気中で5%の二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーターに維持されました。サテライトタンデムリピート試験による細胞株の認証、レポータータンパク質(ルシフェラーゼなど)の発現(存在する場合)の確認、マイコプラズマ感染の有無を確認します。

1. 10 mLの完全増殖培地を使用して、2.0×10^6細胞の播種密度でBT474がん細胞をT75フラスコに播種し、注入前に70%〜80%のコンフルエントに培養します(37°C、5%二酸化炭素)。
2. 注射当日は、増殖培地を廃棄し、細胞単層をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄します。
3. 予熱した細胞培養解離試薬5 mLを添加し、37°Cで5分間、または細胞が剥離するまでインキュベートします。5分後、フラスコを軽くたたいて細胞の剥離を助けます。
4. 10%ウシ胎児血清を含む完全増殖培地5 mLを添加して、解離試薬の活性をクエンチします。
5. ピペッティングで細胞を穏やかに再懸濁し、細胞の凝集を減らします。
6. 細胞懸濁液を50mLのチューブに移し、180 x gで室温で3分間遠心分離します。
7. 上清をデカントし、カルシウムとマグネシウムを含まない10 mLのHank's Balanced Salt Solution(HBSS)に細胞ペレットを再懸濁して、細胞凝集を最小限に抑えます。
8. 細胞懸濁液を室温で180 x gで3分間遠心分離します。
9. 上清をデカントして残留血清/解離試薬を除去し、細胞ペレットをHBSSの3 mLに再懸濁します。
10. 100 μmのセルストレーナーを新しい50 mLのコニカルチューブに置き、細胞懸濁液を通して細胞塊を取り除きます。
    注: 単一細胞懸濁液は、血管の閉塞と注射による脳卒中のリスクを最小限に抑えるために不可欠です。
11. トリパンブルー排除法と血球計算盤を使用して、標準的な方法を使用して生存細胞の数を計算します。
12. 細胞懸濁液をHBSSで2.5 x 10⁶TAG_123}}細胞/mLの細胞濃度に希釈します。
13. 氷の上でチューブを水平に保ち、定期的にチューブを静かに揺らして、凝集を最小限に抑えます。セル懸濁液は氷上に最大6時間保存できます。
    注:ロッキングは手動で行っていましたが、これは低回転のシェーカーを使用して行うこともできます。

2.手順のためのマウスの準備

注:この研究では、4〜5週齢の雌のNOD scidマウスを使用しました。ソフトダイエット回復食品(ダイエットジェル、ハイドロゲル、マッシュマウスチャウなど)を処置の3日前にマウスに導入して、処置後の摂食を促します。

1. オートクレーブ手術用ツール。手術部位と機器に表面消毒剤をスプレーして拭き取り、続いて70%エタノールを拭きます。
2. 低体温症を防ぐために、手術ボードの下に動物用ヒートマットを置きます。手術の30分前にスイッチを入れてください。サージカルボードに表面消毒剤をスプレーして拭き取り、続いて70%エタノールを拭きます。
3. 清潔な動物用ケージと回復用の温かい温熱パッドを準備します。
4. 清潔な個人用保護具(ガウン、マスク、ヘアネット、手袋)を着用してください。清潔な検査用手袋と「器具のヒントのみ」の技術を使用して、手順全体を通して無菌性を維持します。
5. マウスがペダル反射を失うまで、酸素流量が2 L / minの5%イソフルランを使用して麻酔室でマウスに麻酔をかけます。
6. 動物をチャンバーから取り出し、残りの外科的処置のために2L/minの酸素流で2%イソフルランを供給するノーズコーンに入れます。
7. 識別用のイヤーパンチマウスと、首の部分から毛皮を剃るために電気バリカンを使用します。露出した肌の余分な髪をテープできれいにします。
8. 必要な麻酔薬および鎮痛薬の投与量を計算するためにマウスの体重を量ります。皮下注射により、ブプレノルフィンとメロキシカムをそれぞれ50μg / kgと1mg / kgで投与します。.
9. マウスを温かい手術用ボードに移し、ノーズコーンをテープで固定します。
10. 眼の乾燥を防ぐために眼の潤滑剤を目に塗ります。
11. まず、手術用ボードにテープで留めた糸で上顎切歯を引っ掛け、次に前足と後足をテープで固定して、マウスを優しく固定します。このステップにより、体を伸ばし、施術中に首をまっすぐに保ちます。
12. 術前に以下の通り、皮膚の整形を行います。
    1. 局所消毒剤(ポビドンヨード)で首を拭いて、皮膚の微生物叢の負荷を減らし、抜け毛を取り除きます。皮膚の中心からきれいにし、切開部位の再汚染を防ぐために外側に向かって働きます。70%エタノールを使用してプロセスを繰り返します。消毒のためにヨウ素とエタノールを交互に3回繰り返します。
    2. 動物に外科用ドレープを置きます。これは、滅菌済みのペーパータオルまたはオートクレーブバッグからカットして成形します。
13. 手術器具用の滅菌ペーパータオルまたはオートクレーブバッグをレイアウトします。
14. 反射神経via 「ピンチテスト」をチェックして、十分な麻酔を確認してから手順を続行してください。

3. 内部頸動脈注射

注: この実験では、31Gの注入カニューレと足で作動するシリンジドライバーのセットアップを利用して、注射手順を容易にしました。この設定はオプションであり、ユーザーは 31 G インスリン注射器を使用して、手順 3.11 と 3.12 をスキップできます。輸液カニューレを準備するには、2組の縫合クランプを使用して、針部分を31G針のシリンジフィッティング部分から引っ張って分離します。次に、長さ約10cmの細い輸液チューブの一端に針部分を取り付けます。

1. 解剖顕微鏡をマウスの上に置きます。
2. はさみを使用して、顎の5mm下から胸部入口まで、首の領域の正中線に沿って垂直に15mmの切開を行います。
3. 2対の角度付き鉗子を使用して、皮膚とその下にある唾液腺を分け、リトラクターを適用して気管を露出させます。次のステップでは、気管と平行な頸動脈鞘を露出させます。
4. 2対の細かい角度の鉗子を使用して、気管に隣接する筋肉と脂肪組織を鈍く解剖し、右頸動脈鞘を露出させます。頸動脈鞘は、総頸動脈、静脈、迷走神経を覆う線維層であり、この束は真っ赤な総頸動脈によって視覚化できます。この研究では、注射は右頸動脈に対して行われました。
5. 総頸動脈尾側の一部を周囲の筋膜の頸動脈分岐部までクリアし、迷走神経と静脈から分離します。
6. 頸動脈分岐部(外部頸動脈と内部頸動脈を結合する接合部)を周囲の神経と筋膜から分離して除去します。細い鉗子を外頸動脈の下に配置し、動脈の下に絹の縫合糸(厚さ5-0)を通します。縫合糸を結び、締め、余分な線を切ります。
   注: この結紮糸(L1)は、注入液が外部頸動脈を通過するのを防ぎます。
7. 細い鉗子を総頸動脈の下に配置し、動脈の下に絹の縫合糸(厚さ5-0)を通します。結び目を作り、提案された注射部位に近位の位置で縫合糸を締めます。余分な縫合糸をカットし、約10mmの線を残します。
   注: この2番目の結紮糸(L2)は、注射後の血流と出血を制限します。また、注射中に頸動脈を位置決めし、保持するためにも使用されます。
8. (オートクレーブ処理された)低糸くずの使い捨てワイパーのストリップを約10 mm x 5 mmカットして湿らせます。ストリップを4 mm x 5 mm、厚さ2〜3 mmに折り、提案された注射部位の頸動脈の下に置きます。これにより、注入中に血管がサポートされます。
9. 提案された注射部位への総頸動脈吻側に、結び目が緩い3番目の結紮(L3)を配置します。これは、注入後(ステップ3.16)にのみ締められます。
10. 細胞懸濁液を穏やかに撹拌し、200 μLの細胞懸濁液をインスリン注射器(31 G針付き)に吸引します。
11. シリンジをシリンジドライバーにロードし、シリンジドライバーが作動するフットペダルに接続されています。
12. 31Gの針が付いた細いカニューレをシリンジに取り付け、ラインをプライミングします。
13. 頸動脈が適切に配置され、加圧されているかどうかを確認します。
14. 2つの細かい角度の鉗子を使用して、1つは最初の結紮糸の端に優しく張力をかけ、もう1つは31G針を保持し、血管の内腔に斜めの針をゆっくりと挿入します。
15. 100 μL の細胞懸濁液 (ステップ 1.13 から) を総頸動脈に 10 μL/s でゆっくりと注入します。これにより、2.5 × 10^5 個の細胞が血管に送達されます。成功した注射は、頸動脈血管からの血液の除去をviaで視覚化します。
16. 針を引き抜いた直後に、緩い結紮糸(L3)(ステップ3.9から)をそっと持ち上げて締め、逆流や出血を防ぎます。余分な縫合糸をトリミングします。
    注: 針を抜いた後、少量の血液が噴出するのを観察するのは正常です。ただし、3番目の結紮糸が締められた後に活発な出血があってはなりません。
17. 湿らせた糸くずの出ない使い捨てワイパーを取り外します。
18. P200ピペットを使用して、150〜200μLの滅菌水または生理食塩水で手術用空洞を2回すすぎます。
19. にじみがないか再度確認してから、リトラクターを取り外します。
20. 軟部組織、唾液腺、および皮膚を頸動脈と気管の上に再配置します。
21. 縫合糸の針ホルダー、鉗子、および吸収性または非吸収性の6/0モノフィラメント縫合糸を連続パターンで使用して、切開部の皮膚層を閉じます。
22. カニューレニードルシリンジを捨てて、次のマウス用に新しいセットアップを準備します。新しいシリンジを使用すると、各マウスに注入される細胞の数が一定であることが保証されます。
    注: 手順の代表的なスナップショットは、血管が針によって穴を開けたり引き裂かれたりした場合、注射液の漏れや出血によって示され、手順は失敗したと見なされます。これに続いて、針を引き抜き、さらなる出血を防ぐために3番目の結紮糸をすぐに締める必要があります。縫合糸を締めた後も出血が続く場合は、動物をペントバルビタールで安楽死させなければなりません。

4. 注射後の回復

1. ブプレノルフィン(50μg/kg)とメロキシカム(1mg/kg)を注射します。ViaVia{{}}{{}}{{}}皮下注射。
2. 麻酔から回復するために、動物を暖かく清潔なケージに移します。動物が目覚めた後、活動が抑制されている(身を寄せ合って活動していない、またはゆっくりと動き回っている)のは正常です。
3. 30〜45分後、マウスを長期収容施設に移します。
4. 手術後少なくとも1週間はマウスにソフトな食事(ダイエットジェル、ハイドロゲル、マッシュ)を与え、脳卒中、感染、創傷部位周辺の出血の兆候に特に注意して毎日身体状態をチェックします。
5. 手術の2日後、動物は活動性が低下し、毛皮が軽度に波立ち、術前の体重が15%減少するのが一般的です。手術後2〜3日間、鎮痛剤(メロキシカム)を毎日投与して、痛みを管理し、回復を助けます。
6. 3日目以降、動物は活動を取り戻し、摂食とグルーミングの頻度を増やし、体重を取り戻したはずです。手術後4日後に体調不良が続く動物を安楽死させます。ペントバルビタールナトリウムを200 mg/kg 経由 腹腔内注射。
7. 腫瘍の生着と進行は、麻酔と、生物発光イメージング、MRI、PET/MRI などの選択した画像診断法を使用して監視できます。このようなイメージングを行うための要件と能力は、個々のプロジェクトの目的と実施される施設、および使用される細胞株のレポータータグの種類、関連する放射化学および核イメージング施設のアクセシビリティによって異なります。
   注: 一部の動物は、手術が成功したにもかかわらず、うまく反応せず、脳卒中を経験することがあります。処置後、神経学的苦痛の症状(頭を回して片側に引っ張る、旋回行動、転がる、スラッシングする、運動機能の喪失)を示す動物は、直ちに安楽死させなければなりません。

結果

図1:脳転移のための内部頸動脈注射プロトコルの概略図。外頸動脈結紮術による内頸動脈注射は、さまざまな原発がんからの脳転移モデルを確実に作製することができます。このプロトコルでは、3つの結紮糸が頸動脈に配置されます(図ではL1〜L3と注釈されています)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
30G マイクロランス針	BD	23748
31G Ultra-Fine II インスリン注射器	BD	326103
角度付き鉗子	Proscitech	T67A-SS	細かい尖った、鋸歯状のない角度付き、先端18mm、長さ128 mm
動物ヒートマット
抗生物質および抗真菌剤	サーモフィッシャーサイエンティフィ	15240062
BT-474 (HTB-20) 乳がん細胞株	ATCC	HTB-20
ブプレノルフィン (TEMGESIC)
Countess cell counter	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C10227
解剖顕微鏡
耳パンチャー
電動バリカン
細かい角度の鉗子	Proscitech	DEF11063-07	角度 45°, 先端平滑, 先端幅: 0.4 mm, 先端寸法: 0.4 x 0.3 mm, 長さ 9cm
カニューレ用細管, チューブ外径 (in) 1/32, チューブ内径 (in) 1/100in	コールパーマー	EW-06419-00
胎児ウシ血清	ThermoFisher Scientific	26140079
ハンクのカルシウムとマグネシウムを含まないバランス塩溶液	ThermoFisher Scientific	14170120
イソフルラン
Kimwipes 低リント使い捨てワイパー	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
マッシュマウスチャウ
Meloxicam (METACAM)
ノーズコーン			微分管
PAA眼潤滑剤 (カルボマー 2mg/g)	ボシュとロム
ポビドンヨード溶液	Betadine	2505692
PPE (手袋、マスク、ガウン、ヘアネット)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
粘着テープ
手術用ボード			オートクレーブ可能な袋で包まれたまな板。
手術用ハサミ	Proscitech	T104	先端寸法 (LxD): 38x7mm, 長さ 115mm
縫合鉗子/ 湾曲したブロフィー鉗子	Proscitech	T113C	湾曲、丸みを帯びた狭い 2 mm 先端、鋸歯状、長さ 165 mm
縫合糸針ホルダー (Olsen Hegar 針ホルダー)	Proscitech	TC1322-180	長さ 190 mm、ラチェットクランプ
シリンジドライバー(フットペダル付き)/ UMP3 ウルトラマイクロポンプ	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 組織培養フラスコ	サーモフィッシャーサイエンティフィ	156499
Thread
Trigene II表面消毒剤	Ceva

ックから作られましたック