このビデオでは、ヒトの死後脳組織から単離されたニューロメラニン顆粒(NMG)からのペプチドサンプルの分析を示しています。ペプチドは、まず高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて分離され、次に質量分析法で分析され、質量電荷比(m/z)が決定されます。標的ペプチドをフラグメント化して翻訳後修飾を同定し、得られたデータをリファレンスデータベースと比較してNMGのプロテオミクスプロファイルを決定します。
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方法論記事
ヒト脳組織から単離されたニューロメラニン顆粒のプロテオミクスプロファイルのLC-MS/MS分析
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2025年4月28日
この記事について
要約
プロトコル
1.トリプシン消化
1.サンプルを氷上で解凍します。
2.サンプルを真空濃縮器で完全に乾燥させます。
3.サンプルに50 μLの適切な分解バッファー(50 mM重炭酸アンモニウムなど)を充填します。
4.200 mM 1,4-ジチオスレイトールを1.25 μL添加した後、サーモミキサーを使用してサンプルを60 °Cおよび300 rpmで30分間インキュベートし、その後室温(RT)まで冷却します。
5.次に、1.36 μL 0.55 Mヨードアセトアミドを添加した後、室温で暗所で30分間サンプルをインキュベートします。
6.適量のトリプシンをサンプルに加え、サンプルを一晩(~16時間)37°Cでインキュベートします。
注：1,000,000 μm2に対して、0.1 μgのトリプシンで十分であることがわかりました。
7.2.6 μL の 10% トリフルオロ酢酸 (TFA) をサンプルに加えて、分解を停止します (最終濃度 0.5% TFA)。
8.真空濃縮器を使用してサンプルを完全に乾燥させます。次に、定義された最終容量までサンプルを0.1% TFAで充填します。NMGサンプルは最大20 μLまで充填し、そのうち5 μLを1回の質量分析(MS)実験に使用しました。
9.サンプルは、さらに使用するまで-80°Cで保存してください。アミノ酸分析または別の適切な定量方法(Direct Detectなど)により、ペプチド濃度を測定します。
注:サンプル量が少ない場合、上記の手法を使用して定量化できない場合があります。同一のサンプルローディングを確保するには、各サンプルに同じ量の分離組織が含まれ、すべてのサンプルが同等に扱われる必要があります。
2. 高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析
注：以下の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)質量分析(MS)分析は、ここで使用するトラッピングカラムデバイスと質量分析計を備えた特定のLCシステム用に最適化されています（資料の表を参照）).その他の LC および MS システムでは、パラメーターの適応が推奨されます。
- ソフトウェアXcaliburを使用して、以下のようにHPLC設定を調整してください。
- span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>Trap column: 温度を60°C、流速を30μL/minに、ランニングバッファーを0.1%トリフルオロ酢酸に設定します。
- 分析C18逆相カラム：温度を60°C、流速を30μL/minに設定し、緩衝液Aを0.1%トリフルオロ酢酸に、緩衝液Bを84%アセトニトリルに、グラジエントを5%-30%に98分間かけて設定してください。
注：グラデーションの適応は避けられない場合があり、異なる組織や細胞を使用する場合は強く推奨されます。グラジエントの開始時のサンプルのローディングとグラジエントの終了時のサンプル洗浄により、グラジエントの合計時間は異なる場合があります。このプロトコールの全グラジエントは、7 分間のサンプルローディングと 15 分間の追加カラム洗浄で構成され、合計グラジエント時間は 120 分です。
- HPLCソフトウェアロードマップメニューにあるXCalibur Instrument Setupを使用して、データ依存取得(DDA)メソッドを作成してください。
- グローバルパラメータタブで、液体クロマトグラフィーの注入モード、予想されるLCピーク幅(30秒)、デフォルトの充電状態(2)を定義します。
- スキャンパラメータタブに進み、以下のスキャンとフィルタを記載されている順序で追加してください：MS OT、MIPS、Intensity、Charge State、Dynamic exclusion、ddMS2 OT HCDの順に追加してください。
最適なMSおよびDDA設定は、使用する質量分析計やサンプルの種類によって異なる可能性があるため、適合させる必要があります。 - 200-400 ngのサンプルペプチドを規定容量の0.1% TFAに溶解してサンプルを準備します。サンプル量が少ないために濃度測定ができない場合は、Total Ion Current(TIC)を比較して、同一のサンプル負荷量を確認してください。
注:これを行うには、質量分析測定の結果ファイルを適切なソフトウェア、例えばFreeStyleで開き、クロマトグラムを確認してください。強度は、すべてのサンプルで同等である必要があります。代表的なTICを図1に示します。 - プロテオミクスに適したソフトウェア、例えばMaxQuant、Progenesis QI for Proteomics、またはProteome Discovererを使用して得られた生データを分析し、研究課題に基づいて統計データ解析を行います。
3. MaxQuant
- を使用したプロテオミクス生データの分析Load をクリックし、生データヘッダーのMaxQuantソフトウェアに生ファイルをロードします。
- Set Experimentをクリックしてサンプル名を割り当てます。
- グループ固有のパラメータを定義します。まず、変更を加えます。サンプル処理のため、変数修飾として脱アミド化(NQ)、酸化(M)、およびカルバミドメチル化(N末端)を選択し、固定修飾としてカルバミドメチル化(C)を追加します。 消化タブで消化酵素としてトリプシンを選択してください。
- ラベルフリー定量化タブにラベルフリー定量化オプションLFQを追加してください。10 個を超えるファイルを処理する場合は、高速 LFQ オプションを選択して処理時間を短縮します。タンパク質定量の尺度としてiBAQオプションを追加します。
- 他のすべてのグループ固有のパラメータが工場出荷時の設定に残っていることを確認してください。
- グローバルパラメータタブに進み、uniprot.org から派生したFASTAファイルをシーケンスタブに追加してください。それに応じて識別子ルールを変更し、ホモサピエンスの分類ID(この場合は9606)を追加してください。
- タンパク質の定量化には、ユニークペプチドとカミソリペプチドを選択してください。
- 他のすべてのグローバルパラメータが工場出荷時の設定に残っていることを確認してください。
- Startをクリックして、MaxQuant分析後のproteingroups.txt出力を取得し、ペルセウスでさらに分析してください。
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結果
図 1: 120 分間の DDA 測定の総イオン電流 (TIC) クロマトグラムは、0 分から ~105 分の保持時間範囲における溶出ペプチドに対応するイオンの相対的な存在量を示しています。メインカラムを 105th から 120 th 分の間に洗浄すると、クロマトグラムは 105...
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500< | |
| 重炭酸アンモニウム | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| ギ酸 | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| ヨードアセトアミド | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000< | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| トリフルオロ酢酸 | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01< | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| ソフトウェア名 | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| ペルセウス | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific |
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