$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 再現可能なサイズの腫瘍スフェロイドの生成
- びまん性正中神経膠腫(DMG)H3K27M変異ニューロスフィア(NS)を収集し、170 x g室温(RT)で10分間(分)使用してください。
- NSを分解するには、アキュターゼ溶液500μLを37°Cで3分間インキュベートします。
- 腫瘍幹細胞(TSM)培地でアキュターゼ溶液を中和します7355 x style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>g RTで5分間。
- 細胞ペレットを1 mLのTSM培地に再懸濁し、細胞計数チャンバーを使用して細胞を連続させます。
- 細胞懸濁液を希釈して2.5-5 x 103 細胞/mLおよびシード100 μL/ウェルを超低接着(ULA)96ウェル丸底プレートに注入））<span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Table of Materials).適切な細胞密度を使用して、細胞播種から 4 日後に直径 ~300 μm の個々の NS を取得します (非常に侵攻性の高い神経膠腫細胞の場合は 250-500 細胞/ウェル)。
- 細胞播種から4日後に倒立顕微鏡を用いて、NS形成を目視で確認します。
2. 移行アッセイのための抗体標識試薬(ALR)/抗体複合体の準備とセットアップ
- 分析するウェルの数を考慮し、各試薬に必要な量を計算してください。ネガティブコントロールに必要なウェルも含めます。開始する前に、倒立顕微鏡を使用してNSを目視で確認してください。
- 平底の96ウェルプレートを使用してください。コーティングを行います。この研究では、基底膜マトリックス(BMM)を薄いコーティングとして使用します。
- コーティングの準備ができたら、p200チップで余分なBMMコーティングを取り除き、チップをウェルの端に置き、底に触れないようにします。複数のウェルを扱う場合は、マルチチャンネルピペットを使用してください。
- p200チップをカットし、選択した各ウェルから50μLの細胞培地+ NSを取り出し、コーティングされた平底ウェルに移します。各ウェル内のNSの存在と位置を視覚的に確認します。
注: 各NSは、井戸の中央に配置されている必要があります。移し替え中はウェルの端に先端をもたれかけないようにし、底に触れずに培地をウェルの中央に落とします。移動性の高い細胞の場合は、標準の3回の繰り返しよりも多くの繰り返し数を検討してください。これは、NSがウェルの端に近すぎると、移動する細胞がウェルのより小さな領域を覆う可能性があるためです。 - ALRに滅菌水100μLを加えて、試薬を再水和します(最終濃度= 0.5 mg/mL)。<span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'注: 試薬は光に敏感です。したがって、暗闇に保管してください。残った試薬を分注し、-80°Cで保存します(凍結融解は避けてください)。
- 丸底マルチウェルプレートまたはアンバーチューブ内の適切な全細胞増殖培地で抗体をALRと混合し、光から保護します。最終アッセイ濃度の3倍で50 μL/ウェルを分注するのに十分な量を準備します。室温で15分間インキュベートします。
- バックグラウンドサプレッサー試薬(BSR)をTSM培地(または選択した細胞株に適した細胞増殖培地)で1.5 mM(3x)に希釈し、アッセイの終了時に最終濃度0.5 mMを得ます。
NOTE:試薬は光に敏感です。適切な取り扱い手順については、上記を参照してください。 - 各ウェルに50μLのBSRを静かに加えます。
- 各ウェルに50 μLのALR/抗体を静かに加えます。2〜3分待って試薬を混合し、倒立顕微鏡を使用して目視で確認し、ほとんどの複製NSがウェルの中央に配置されていることを確認します。
- 気泡の形成を避け、針を使用して既存の気泡を取り除きます。インキュベーター内に設置した生細胞分析装置でプレートを37°C、5%CO< style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>2、湿度95%。
3. 画像取得のためのライブセル分析装置の設定
- ライブセル分析装置を使用してプレートをスキャンします><） Materials) を、ステップ2.14の後にそれぞれ設定された侵入と移動アッセイの時間ゼロ(t0)から始まるスキャン間隔で設定します。および 3.10.96時間まで。
NOTE: 生細胞解析装置は、インベージョンおよびマイグレーションアッセイの開始直後に廃棄できるようにしてください。腫瘍の種類にもよりますが、細胞はアッセイセットアップから1時間以内にすでにNSから浸潤または移動を開始する可能性があります。 - ライブセル解析装置ソフトウェアで、オプションを選択Schedule to Acquire.+タブをクリックし、オプションを選択します。 スケジュール通りにスキャン.
- ソフトウェアウィンドウでCreate or Restore Vessel、オプションをクリックしてください。 New.
- 浸潤および遊走取得のための生細胞解析装置内の特定のアプリケーションを選択します。選択 回転楕円<span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>スキャンタイプ、4倍、目的 Phase+Brightfield とGreen インベイジョンアッセイの画像チャンネル。<span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'Dilution Cloningスキャンタイプ、4倍、目的、 Phase と Green 移行アッセイ用。
- プレートタイプを選択し、プレートマップ上でハイライトしてスキャンするウェルを定義します。
- スキャン頻度を設定します(このプロトコルの実験では、スキャン頻度は侵入で15分、移動で30分でした)。
- Add to Schedule スキャンを開始します。