私たちは、環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分子を分離する効率的な方法を説明します。核酸はリン酸含有緩衝液の濃度の増加とともにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて分画する。このメソッドは、環境サンプルからすべてのウイルス核酸の種類の分離を可能にします。
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方法論記事
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離
この記事について
サマリー
要約
ウイルス、特にバクテリオファージは（ファージ）、地球1,2上で最も多くの生物学的実体である。ウイルスは宿主細胞の表現型を変更する、栄養素の循環に寄与する、宿主細胞の豊富さと多様性を調節し、そして遺伝子の3の水平伝達を介して宿主細胞とウイルスの両方のコミュニティの進化に影響を与える。多くの研究は、自然環境の様々なウイルスやその機能性の驚異的な遺伝的多様性を強調している。
メタゲノムの手法は、分類学的多様性とメンバー一本鎖DNA（ssDNA）、二本鎖DNA（dsDNA）とRNAの遺伝子型4-9含む複雑なウイルス群集の機能的な可能性を研究するために使用されている。環境DNAを含む研究に使用される現在のライブラリー構築のプロトコルまたはRNAを含むウイルスは、10非標的化テンプレートを除去するために、初期ヌクレアーゼ処理を必要とする。しかし、ウイルスのコミュニティとウイルスの多様性の集団遺伝子の補数の包括的な理解には関係なく、ゲノム構成のすべてのメンバの知識が必要です。核酸のサブタイプの精製分画は、コミュニティの遺伝の署名の一部を犠牲にすることなくウイルスの集合体を研究することによって効果的なメカニズムを提供します。
ハイドロキシアパタイト、リン酸カルシウムの結晶形は、1960年代11日以来、核酸、ならびにタンパク質や微生物の分離に用いられている。ハイドロキシアパタイトと核酸のサブタイプの負に帯電したリン酸骨格の陽性荷電のCa 2 +イオン間の電荷の相互作用を利用することにより、それは優先的に互いに独立してそれぞれの核酸のサブタイプを溶出することが可能です。我々は最近、DNAシークエンシング12の準備にssDNAのは、dsDNAやRNAを含むウイルスの独立画するゲノムにこの戦略を採用。ここで、我々は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィを用いて混合したウイルスの集合体からのssDNA、dsDNAをし、RNAウイルス核酸の分画と回復のための手法を提案する。
プロトコル
1。溶液の調製
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行う前に、リン酸緩衝液を準備する必要がありますし、ハイドロキシアパタイトは、適切に水和でなければなりません。
- 1Mリン酸溶液、pHを6.8：1Lフラスコ中の滅菌、DEPC処理H 2 O 1Lのナトリウムリン酸一塩基の119.98グラムを溶解滅菌、DEPC処理H 2 O 1Lのナトリウムリン酸二塩基の141.96グラムを溶解することによって1Lフラスコに1Mリン酸ナトリウム、二塩基溶液を調製1:1の割合でモノ - 及びジ - ソリューションを組み合わせる。マグネチックスターラーバーを用いて撹拌プレートとのミックスでフラスコを置きます。水酸化ナトリウム（pHを増加させる）またはリン酸（pHを下げるために）追加することで6.8にpHを調整する。
- 0.12Mリン酸緩衝液：500ミリリットルのフラスコで、1Mリン酸溶液、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のpHを6.8、2.5ミリリットル、および0.5M EDTA 5mlのの30ミリリットル組み合わせる。 225ミリリットルの容積に無菌、DEPC処理水を追加。 6.8にpHを調整する。 250ミリリットルに滅菌、DEPC処理水を追加。オートクレーブ。
- 0.18Mリン酸緩衝液：500ミリリットルのフラスコで、1Mリン酸溶液、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のpHを6.....
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ディスカッション
ここで紹介するハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの手法は、目的は社会の総核酸組成を研究する場合の混合ウイルスの集合体からの核酸の分画のための非常に効率的かつ堅牢なツールです。一般的に、ssDNAを、RNAおよび二本鎖DNAは約〜0and 0.40Mそれぞれより大きい列フォーリン酸塩緩衝液の濃度から溶出されます。それが既知の核酸（耕作ウイルス調製からなど）を使用して、それぞれ準備をテストすることが重要であるので、しかし、ハイドロキシアパタイトの各調製物は、わずかに異なる組成及び溶出プロファイルを持つことができます。これにより、ユーザは所望の核酸を溶出するために必要なリン酸塩含有バッファの特定の濃度を把握することができます。
このテクニックの制限要因は、核酸のリン酸骨格を結合することができるハイドロキシアパタイト内に存在可能なのCa 2 +イオンの量です。列内のハイドロキシアパタイトのcapacityamountは、列に拡大または縮小することができます（ウォータージャケット列と使用されるハイドロキシアパタイトの量の大きさによって決まる）と溶.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この研究は、科学（BER）、米国エネルギー省、協力協定がないの局によってサポートされていました。デFC02 - 02ER63453、国立科学財団の微生物ゲノムシーケンシングプログラム（受賞番号0626826と0731916）。我々は、環境サンプルのコレクションを持つ彼の援助のための彼の技術的専門知識とアドバイスとK.エリックWommack用ジョングラスに感謝。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 材料名 | 会社 | カタログ番号 | カタログ番号 |
| エコノ-カラム | Bio - Rad社 | 737-0717 | 0.7センチメートルIDのパッケージ/ 2 |
| ヒドロキシアパタイト | Bio - Rad社 | 130-0520 | DNAグレードバイオジェルHTPジェル、100g/td> |
| リン酸ナトリウム、一塩基性 | VWR | VW1497 - 01 | 一水和物、クリスタル500グラム |
| リン酸ナトリウム、二塩基性 | VWR | VW1496 - 01 | 無水、パウダー500グラム |
| DEPC処理水 | インビトロジェン | AM9922 | 1L |
| 10％SDS溶液 | インビトロジェン | 24730-020 | 超高純度、1L |
| 0.5M EDTA | インビトロジェン | AM9262 | pHは8.0、1L |
| Sigmacote | シグマアルドリッチ | SL2 - 25ML | |
| 2ミリリットル血清学的pippette | VWR | 89130-884 | ポリスチレン、滅菌 |
| BDファルコン遠心管 | VWR | 21008-936 | 15ミリリットル、滅菌 |
| フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、V / V / V） | インビトロジェン | 15593-031 | 超高純度、100ミリリットル |
| アミコンウルトラ-4遠心装置 | ミリポア | UFC803024 | Ultracel - 30膜 |
| 20X TEバッファー、RNaseフリー | インビトロジェン | T11493 | 100ミリリットル |
| Glycoblue | インビトロジェン | AM9516 | 15mg/ml |
参考文献
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
- Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. ....
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再版と許可
