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1. 小腸神経内分泌腫瘍(SBNET)の収集と細胞解離
- Surgical Pathology Coreから腫瘍組織の確認後、切除された患者のSBNETサンプルを取得してください。
- SBNETを5mmの立方体に切り取り、25mLのDulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12培地に円錐形のチューブに入れて実験室に輸送します。
- 腫瘍を1%のウシ胎児血清またはFBS、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/Strep)、および1%グルタミン(Wash Medium)を含むDMEMに移し、この洗浄培地で15分間インキュベートします。
- 腫瘍を新しい皿に移し、滅菌した湾曲したハサミを使用して直径1mm未満の断片に細かく刻みます。
- ミンチした組織を、25mLのウォッシュメディウムが入った新しい50mLチューブに移します。
- サンプルを500 x gで4°Cで15分間遠心分離します。
- 上清を捨て、コラゲナーゼ(100 U/mL)とDNase(0.1 mg/mL)を含む10 mLの洗浄培地にペレットを再懸濁してください。
- 37°Cのインキュベーターで1.5時間ゆっくりと振と
うしながら、細かく刻まれた腫瘍を消化させてください。
2.Extra Cellular Matrix(ECM)での腫瘍スフェロイドとしてのSBNETの培養<
- span style='background-color:transparent;color:#000000;'>消化が完了した後（ステップ1.8)、500 x gで4°Cで15分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを15mLの洗浄培地に再懸濁します。
- 新しい50mLチューブの上に70μmのセルストレーナーを置き、10mLの洗浄培地をセルストレーナーの上に移します。ウォッシュメディウムを回転させてプラスチックチューブの側面を覆い、NET細胞がプラスチックチューブの側面にくっつくのを防ぎます。
- セルストレーナーを通してセル懸濁液をフィルタリングします。
- 500 x gで4°Cで15分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを200 μLの洗浄培地(総容量は~250 μL)に再懸濁し、氷の上に置きます。
- 5 μLの細胞を500 μLの洗浄培地(1/100希釈係数)に移します。希釈した細胞を血球計算盤で細胞計数に用い、ミリリットル当たりの細胞数を求めます。100を掛けて、希釈係数を補正します。
- ステップ2.5で得られたmLあたりの細胞数に、ステップ2.4で得られた懸濁液中の細胞の総量（~250μL）を掛けます。
- 500 x gで4°Cで15分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を液体ECM(1 x 106細胞/mL)に再懸濁し、氷上に保ちます。
- 5-20 μLのSBNETスフェロイドをECMの96ウェルプレートに移し、プレートを37°Cのインキュベーターに5分間置いて液体ECMを固化させます。
- 200 μLのSBNET培地（DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamine + 10 mM nicotinamide + 10 μg/mL insulin)をECM中のSBNETスフェロイドを含む96ウェルプレートの各ウェルに加えます。
- あるいは、以前にヒト肝臓または膵臓オルガノイドの増殖について説明し、材料の表に記載されているものと同様の幹細胞培地でのSBNETオルガノイドの培養を行います。
- 5-7日ごとにメディアを交換してください。
3. 免疫蛍光
- によるSBNETSスフェロイドの特性評価ECMで成長させたオルガノイドをP1000ピペットを使用して1.5mLのチューブに移します。
- 1,500 x gで1分間遠心分離し、上澄み液を取り除きます。
- オルガノイド培養物を1mLのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSを加えて洗浄し、混合し、1,500 x gで1分間遠心分離し、上清を取り除きます。
- オルガノイドを4%パラホルムアルデヒド500μL加えて固定し、15分間インキュベートしてください。
- 1mLのPBSで培養物を2回洗浄してください。
- 500μLのPBS + 3%ウシ血清アルブミンまたはBSA + 0.1% Triton X 100を5分間加えて、培養液を透過化します。
- 次に、1mLのPBS + 3% BSAで3回洗浄します。
- シナプトフィジン(SYP)に対する一次抗体を1/600希釈で、またはクロモグラニンA(CgA)とソマトスタチン受容体2(SSTR2)を1/400希釈で抗体バッファー(2.5%ウシ血清アルブミン、0.1%アジ化ナトリウム、25mMトリスpH7.4、150mM塩化ナトリウム)で1時間インキュベートします。
注:チューブごとに300 μL以上の抗体溶液を使用してください。 - 1mLのPBS + 3% BSAで3回洗ってください。
- 抗体バッファーで1/500希釈のFITCに結合した二次抗体と1時間インキュベートします。チューブごとに300μL以上の抗体溶液を使用してください。
- 1mLのPBS + 3% BSAで3回洗ってください。必ず吸引して、すべての上清を捨ててください。
- 核染色DAPIを含む5μLの封入剤を追加してください。
- P20ピペットを使用して、ステップ4.12のSBNETスフェロイド5μLをスライドガラスに移し、カバースリップで密封してください。
- 蛍光顕微鏡で10倍、20倍、または40倍の対物レンズを使用して画像を撮影します。