免疫蛍光法を用いた小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの特性評価

要約

出典:Ear, P. H., et.al. 小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの確立と特性評価。J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの免疫蛍光染色を示しています。スフェロイドを固定、透過処理、ブロックした後、一次抗体および二次抗体とインキュベートします。色素を添加して核を染色してから、マウントし、蛍光顕微鏡で可視化します。

プロトコル

1. 小腸神経内分泌腫瘍(SBNET)の収集と細胞解離

1. Surgical Pathology Coreから腫瘍組織の確認後、切除された患者のSBNETサンプルを取得してください。
2. SBNETを5mmの立方体に切り取り、25mLのDulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12培地に円錐形のチューブに入れて実験室に輸送します。
3. 腫瘍を1%のウシ胎児血清またはFBS、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/Strep)、および1%グルタミン(Wash Medium)を含むDMEMに移し、この洗浄培地で15分間インキュベートします。
4. 腫瘍を新しい皿に移し、滅菌した湾曲したハサミを使用して直径1mm未満の断片に細かく刻みます。
5. ミンチした組織を、25mLのウォッシュメディウムが入った新しい50mLチューブに移します。
6. サンプルを500 x gで4°Cで15分間遠心分離します。
7. 上清を捨て、コラゲナーゼ(100 U/mL)とDNase(0.1 mg/mL)を含む10 mLの洗浄培地にペレットを再懸濁してください。
8. 37°Cのインキュベーターで1.5時間ゆっくりと振と

うしながら、細かく刻まれた腫瘍を消化させてください。

2.Extra Cellular Matrix(ECM)での腫瘍スフェロイドとしてのSBNETの培養<

1. span style='background-color:transparent;color:#000000;'>消化が完了した後（ステップ1.8)、500 x gで4°Cで15分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを15mLの洗浄培地に再懸濁します。
2. 新しい50mLチューブの上に70μmのセルストレーナーを置き、10mLの洗浄培地をセルストレーナーの上に移します。ウォッシュメディウムを回転させてプラスチックチューブの側面を覆い、NET細胞がプラスチックチューブの側面にくっつくのを防ぎます。
3. セルストレーナーを通してセル懸濁液をフィルタリングします。
4. 500 x gで4°Cで15分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを200 μLの洗浄培地(総容量は~250 μL)に再懸濁し、氷の上に置きます。
5. 5 μLの細胞を500 μLの洗浄培地(1/100希釈係数)に移します。希釈した細胞を血球計算盤で細胞計数に用い、ミリリットル当たりの細胞数を求めます。100を掛けて、希釈係数を補正します。
6. ステップ2.5で得られたmLあたりの細胞数に、ステップ2.4で得られた懸濁液中の細胞の総量（~250μL）を掛けます。
7. 500 x gで4°Cで15分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を液体ECM(1 x 10⁶細胞/mL)に再懸濁し、氷上に保ちます。
8. 5-20 μLのSBNETスフェロイドをECMの96ウェルプレートに移し、プレートを37°Cのインキュベーターに5分間置いて液体ECMを固化させます。
9. 200 μLのSBNET培地（DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamine + 10 mM nicotinamide + 10 μg/mL insulin)をECM中のSBNETスフェロイドを含む96ウェルプレートの各ウェルに加えます。
10. あるいは、以前にヒト肝臓または膵臓オルガノイドの増殖について説明し、材料の表に記載されているものと同様の幹細胞培地でのSBNETオルガノイドの培養を行います。
11. 5-7日ごとにメディアを交換してください。

3. 免疫蛍光

1. によるSBNETSスフェロイドの特性評価ECMで成長させたオルガノイドをP1000ピペットを使用して1.5mLのチューブに移します。
2. 1,500 x gで1分間遠心分離し、上澄み液を取り除きます。
3. オルガノイド培養物を1mLのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSを加えて洗浄し、混合し、1,500 x gで1分間遠心分離し、上清を取り除きます。
4. オルガノイドを4%パラホルムアルデヒド500μL加えて固定し、15分間インキュベートしてください。
5. 1mLのPBSで培養物を2回洗浄してください。
6. 500μLのPBS + 3%ウシ血清アルブミンまたはBSA + 0.1% Triton X 100を5分間加えて、培養液を透過化します。
7. 次に、1mLのPBS + 3% BSAで3回洗浄します。
8. シナプトフィジン(SYP)に対する一次抗体を1/600希釈で、またはクロモグラニンA(CgA)とソマトスタチン受容体2(SSTR2)を1/400希釈で抗体バッファー(2.5%ウシ血清アルブミン、0.1%アジ化ナトリウム、25mMトリスpH7.4、150mM塩化ナトリウム)で1時間インキュベートします。
   注:チューブごとに300 μL以上の抗体溶液を使用してください。
9. 1mLのPBS + 3% BSAで3回洗ってください。
10. 抗体バッファーで1/500希釈のFITCに結合した二次抗体と1時間インキュベートします。チューブごとに300μL以上の抗体溶液を使用してください。
11. 1mLのPBS + 3% BSAで3回洗ってください。必ず吸引して、すべての上清を捨ててください。
12. 核染色DAPIを含む5μLの封入剤を追加してください。
13. P20ピペットを使用して、ステップ4.12のSBNETスフェロイド5μLをスライドガラスに移し、カバースリップで密封してください。
14. 蛍光顕微鏡で10倍、20倍、または40倍の対物レンズを使用して画像を撮影します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗ウサギFITC	ジャクソン免疫研究	11-095-152	緑色蛍光体への二次抗体結合
Autostainer Link 48	アジレントダコ	取り扱いなし	抗体染色用自動システム
細胞凍結容器	サーモサイエンティフィック	5100-0001	細胞凍結用容器
CellSence	Olympus	Version 1.18	蛍光顕微鏡用コンピュータソフトウェア
クロモグラニンA抗体	Abcam-45179	RB-9003-PO	抗体IF
コラゲナーゼ	シグマ	C0130	腫瘍組織消化酵素
DMEM	ギブコ	11965-092	組織調製用培地
DMEM/F12	ギブコ	11320-033	オルガノイド培養用培地
DNAse	Sigma	DN25	腫瘍組織消化酵素
FBS	Gibco	16000044	培地用試薬
蛍光顕微鏡	オリンパス	CKX35	SBENTスフェロイド撮影用顕微鏡
グルタミン	ギブコ	A2916801	培地用試薬
インスリン	シグマ	I0516	培養用試薬メディア
マトリゲル	コーニング	356235	オルガノイドを埋め込み固定するためのマトリックス
封入剤(VECTASHIELD)	ベクターラボラトリーズ	H-1200	核標識細胞用固定剤染色剤
ニコチンアミド	シグマ	72340	培地用試薬
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡科学誌	15710	細胞固定試薬
PEN/STREP	ギブコ	15140-122	培地用試薬
SSTR2抗体	GeneScritp	A01591	IF
シナプトフィジン抗体用抗体	アブカム	32127	IF
TritonX用抗体	Mallinckrodt	3555 KBGE	細胞透過試薬
Y-2763 ROCK阻害剤	アディポゲン	AG-CR1-3564-M005	凍結融解後のSBNETスフェロイド生存率を向上させるため