急性マウス脳切片における酸素消費率の測定

要約

出典:Zhi, L. et al., Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice.J. Vis. Exp. (2022).

このビデオでは、マウスの線条体脳切片におけるミトコンドリア酸素消費率(OCR)の測定方法を示します。ティッシュプレートとセンサーカートリッジを準備し、フラックスアナライザーにロードする手順と、OCRパターンの基礎となる細胞プロセスについて詳しく説明します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. ハイドレートカートリッジセンサー(アッセイの1日前)

1. 細胞外フラックスアッセイキットを開き(Table of Materialsを参照)、センサーカートリッジ(緑)とユーティリティプレート(透明;図 1A)。センサーカートリッジを脇に置き(センサーを上にして)、センサーに触れないでください。
2. 600 μLのキャリブラント溶液(pH 7.4)をユーティリティプレートの各ウェルに加えます。センサーカートリッジをユーティリティプレートの上に置き、センサーをキャリブラント溶液に浸します。ユーティリティとセンサーカートリッジプレートの三角形のノッチが正しく位置合わせされていることを確認してください(図1B)。
3. 細胞外フラックスアッセイキットをシーリングフィルムで密封してキャリブラント溶液の蒸発を防ぎ、CO₂または酸素を補給していない37°Cのインキュベーターに一晩置いてください。

2.組織プレートを準備します(アッセイ当日)

1. 膵島キャプチャマイクロプレートを開き、組織を座らせるために膵島プレートを取り出します。
2. 適切な容量(ウェルあたり625 μL)の予酸素化修飾人工脳脊髄液(ACSF、組成140 mM NaCl、2.5 mM KCl、2.4 mM CaCl₂、1.3 mM MgSO₄、0.3 mM KH₂PO₄、25 mMグルコース、 10 mM HEPES、pH 7.2)緩衝液を50 mLチューブで37°Cまで保存します。次に、BSAを最終濃度4 mg / mLまで追加して、呼吸緩衝液を調製します。一般的には、1枚のプレートに50mLで十分です。
3. 625 μLの呼吸緩衝液(25 mMグルコースと4 mg/mL BSAを含む予備酸素化ACSF緩衝液)を膵島プレートの各ウェルに慎重に加え、プレートを振らないようにします。センサーカートリッジの上部に残留液滴がなく、各ウェルのバッファーに気泡が存在しないことを確認します。

3.急性線条体スライスの準備と切除スライスの配置

1. 子宮頸部脱臼後にマウスを斬首し、すぐに10 mLの氷冷予備酸素化切断溶液(125 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO₃、3.7 mM MgSO₄、 0.3 mM KH₂PO₄, 10 mM グルコース, pH 7.4)。
2. 刻印状線条体スライスは、製造元の指示に従って(材料表を参照)、氷冷の酸素化済み切断液で厚さ150μmでビブラトームでスライスします。
3. 50 mL の酸素化 ACSF (125 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO₃、2.4 mM CaCl₂、1.3 mM MgSO₄、0.3 mM KH₂PO₄、10 mM グルコース、 2 mM HEPES、pH 7.4)を溶液中で室温(RT)で最大30分間保存してください。
4. 回収後、スライスを5mLの呼吸緩衝液を入れた35 mm x 10 mmのシャーレに移します。
5. ステンレス製の生検パンチ(直径1.5mmなど)を使用して、スライスした脳の目的の領域に円形の組織片を作成します。スライスをバッファーに入れたまま、パンチで軽く押し下げます。パンチが組織を切るのに十分なほど強く押し下げられていることを確認してください。残りの組織を取り除き、パンチを持ち上げて離し、円形の組織片をバッファーに移します。
6. 1 mLピペットチップの先端をカットして直径1.5〜2.0 mmの穴を開け、それを使用してパンチスライスを保持し、キャプチャ画面の上部に移します。パンチングされた脳組織を1枚吸引し、キャプチャ画面のメッシュ側に組織を慎重に配置します(図2A)。キャプチャ画面は、メッシュが片側に取り付けられた円形のプラスチック片になります。
   注:キャプチャー画面はマイクロプレートパックに含まれています(資料表を参照)。
7. ペーパーティッシュをそっと使用して、キャプチャ画面を短時間乾かします。水分が取り除かれると、組織がべたつくようになり、スライスがメッシュの中心に付着できるようになります。スライスを乾かしすぎると損傷を受けるため、乾燥させすぎないでください。
8. キャプチャースクリーンのスライス面を下にしてピンセットで保持し、インキュベーション膵島プレートのウェルの1つに入れます(図2B)。スライスを落とさないように注意してください。その場合は、画面を取り出して、新しいスライスをその上に置きます。
   注: 膵島プレートの2つの背景補正ウェル(A1とD6)に脳のスライスを入れないでください。
9. アッセイを実行する前に、アイレットプレートをインキュベーター内で37°Cで少なくとも30分間インキュベートし、温度とpHの平衡化を確保します。

4. 所望の化合物をカートリッジに装填する

1. 改質ACSF(37°C)で所望の化合物を最終ストック濃度の10倍、11倍、12倍、13倍に希釈し、ポートAからDまでそれぞれ作動濃度の10倍、11倍、12倍、13倍に希釈し、pH 7.4に調整します。このテストでは、ポートAからDの順に化合物を投与します。この実験では、10 mM ピルビン酸 (ポート A)、20 μM オリゴマイシン (ポート B)、10 μM またはその他の濃度のシアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン (FCCP) (ポート C)、および 20 μM アンチマイシン A (ポート D) の溶液を使用しました。
2. 希釈した化合物75 μLをセンサーカートリッジの適切な注入ポートに静かにプリロードします。先端を注入ポートの壁に当てて、先端を45°の角度で注入ポートの途中に配置します。先端を注入ポートの底部に完全に挿入しないでください。注入ポートから化合物が漏れる可能性があるためです。
3. 気泡が発生しないように、先端をポートから慎重に引き出します。気泡の緩和を避けるために、カートリッジのどの部分にも触れないでください。
4. 注入ポートを目視検査し、均一な負荷を確保します。すべての液体がポートにあり、カートリッジの上部に液滴が残っていないことを確認します。
5. センサーカートリッジをユーティリティプレートに置き、インキュベーター(非CO₂)に30分間入れて、再び37°Cまで加熱します。ユーティリティプレートだけを持って慎重に取り扱ってください。できるだけ動かないようにします。

5. キャリブレーションとアッセイの実行

1. ソフトウェアにアッセイテンプレートをロードします。緑色のSTART ボタンを押します。
2. 正しいプロトコルを読み込んでください。このプロトコルには、3 分間の混合、3 分間の待機、および 2 分間の測定シーケンスの組み合わせが含まれています (これら 3 つのステップが 1 つの測定を形成します)。プローブヘッドの距離を26,600から27,800に変更します(機器設定のハードウェア設定)。XFe24アナライザのプローブヘッドを交換する必要はありません。START を押します。
3. ユーティリティプレートのセンサーカートリッジを機器トレイにセットします。ノッチは左前隅にあります。プレートが正しく収まり、平らであることを確認します。薬物を充填したセンサーカートリッジをアナライザーにロードして校正します。
4. 画面の指示に従って、センサーのキャリブレーションと平衡化を行います。これには約30分かかります.
5. キャリブレーションステップが完了したら、キャリブレーションプレートを取り外し、アイスレットプレート(メッシュと組織スライスを含む)と交換します。
6. アッセイプロトコルを使用して、プレートの各ウェルの酸素消費量を測定します。このプロトコルには、3 分間の混合、3 分間の待機、および 2 分間の測定シーケンス (これら 3 つのステップが 1 つの測定を形成します) の組み合わせが含まれており、その時点で酸素消費率 (OCR) が計算されます。
7. 実験全体では、4x OCR測定を含めてベースラインを作成し、続いてポートA(ピルビン酸)を注入して4倍測定を行い、次にポートB(オリゴマイシン)を注入して8倍測定を行い、次にポートC(FCCP)を注入して5倍測定を行い、最後にポートD(アンチマイシンA)を注入して6倍測定を行います。
   注: 各化合物注入後のこの測定回数は、測定がいつプラトーに達するかによって決定されます。
8. OCR測定データと結合効率データを解析します。

結果

図1:細胞外フラックス分析装置のハイドレートカートリッジセンサーとプレートを示す画像 (A) キャリブレーションプレート(ユーティリティプレート)の上に座っているセンサーカートリッジ。(B)ユーティリティプレートとセンサーカートリッジプレートの側面図。ユーティリティとセンサーカートリッジプレートの三角形のノッチは正しく位置合わせされている必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Accumet AB150 pH benchtop meter	サーモフィッシャーサイエンティフィ	13-636-AB150	To measure pH
アンチマイシンA fromストレプトマイセス属	SIGMA	A8674	To inhibit complex III of the mitochondria
ウシ血清アルブミン(BSA)	SIGMA	A6003	To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)
シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン (FCCP)	SIGMA	C2920	To uncouple mitochondrial respiration
D-Glucose	SIGMA	G8270	人工脳脊髄液(ACSF)を作るために)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	人工脳脊髄液(ACSF)を作るには)
加湿非二酸化炭素インキュベーター	FisherScientific	11-683-230D	To hydrate plates at 37 °C
Streptomyces diastatochromogenes由来のオリゴマイシン	SIGMA	O4876	To inhibit mitochondrial ATP synthase
パラフィルム	SIGMA-ALDRICH		シーリングフィルム
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	タツノオトシゴバイオサイエンス	103681-100<
Seahorse XF 細胞外フラックスアナライザー	タツノオトシゴバイオサイエンス		酸素消費率の分析に使用された機器、古い世代
タツノオトシゴXFe24 Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		酸素消費率の分析に使用される機器、新世代
タツノオトシゴ XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100<
ピルビン酸ナトリウム	SIGMA	P2256	基板供給の制約を防ぐために<
ステンレス鋼の生検パンチ	Miltex		スライスを打ち抜くために使用されるデバイス
滅菌細胞培養皿、35 x 10 mm	Eppendrof	30700102	スライスパンチに使用
ビブラートメ	Leica	VT1200	To slice brain tissue
ウォーターバス	Thermo Scientific Precision	282-115	バッファと解決策を熱する

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