エラスターゼ処理血管パウチを用いたウサギの実験的動脈瘤モデルの開発

要約

出典:Wanderer, S., et al.ウサギの動脈ポーチ顕微外科分岐動脈瘤モデル。J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、エラスターゼ処理した血管ポーチを使用してウサギの実験用動脈瘤モデルを作成する方法を示します。右CCAの一部を切除した後、パウチをエラスターゼで処理し、左CCAに縫合して血流を回復させます。その結果、弱くなったポーチ壁にストレスがかかり、動脈瘤の形成が誘発されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

注: すべての動物を摂氏22〜22224度の室温で飼育し、12時間(h)の明暗サイクルを維持します。毎回、水、ペレット、および自由な干し草の食事への無料アクセスを提供します。統計分析は、ノンパラメトリックWilcoxon-Mann-Whitney-U検定を使用して実行されました。0.05≤の確率値(p)は有意であると考えられました。

1. 手術前段階

1. 手術予定のウサギ全員について、23±3°Cの温度を維持しながら、静かな無菌手術室のすぐ隣で詳細な術前臨床検査を行います。
   1. 各動物の体重を巨視的に記録し、粘膜を評価します。 キャピラリーの補充時間、および脈拍の品質。
   2. さらに、聴診器と腹部触診による心臓聴診を行います。
   3. 臨床所見に基づいて、米国麻酔科学会(ASA)の分類を各ウサギに帰属させます19。ASA Iスコアの動物のみを研究に含めます。
   4. 電気シェーバーで両外耳を剃り、耳介動脈と静脈の両方にプリロカイン-リドカインクリームを塗ります。
2. 20ミリグラム(mg)/キログラム(kg)のケタミン、100 mg / kgのデクスメデトミジン、および0.3 mg / kgのメタドンを注射器を介して皮下(SC)に注射してウサギを鎮静させます。.
4. その後、緩いフェイスマスクを通じて3リットル(l)/分(分)の酸素補給とパルスオキシメータによる安定したモニタリングの下で、左耳介中央動脈に22Gカニューレを、対側耳の耳介静脈に別の22Gカニューレを留置します。
5. 術野(首)を剃り、切開周囲ロピバカイン0.75%を皮内に注入します。次に、額を剃り、小児脳波(EEG)センサーを配置する準備をします。
6. プロポフォール 1-2 mg/kg を静脈内 (IV) で全身麻酔を誘発します。次に、カプノグラフィー制御下で、シリコンチューブ(内径3ミリメートル(mm))ですべてのウサギの気管に直ちに挿管します。その後、すべてのウサギを手術室に運び、背側横臥に置き、チューブを小児サークルシステムに接続します。
7. 酸素中のイソフルランを通じて麻酔の深化と維持を達成し、最大呼気終末イソフルラン濃度1.3%を目標としています。
8. 気管抜管まで、臨床的および機器的なモニタリング(パルスオキシメトリー、ドップラー、侵襲的血圧、3誘導心電図、EEG、直腸温モニタリング、吸入ガスと呼気ガス)を確保します。
9. 水分補給を維持するために、リンゲル乳酸は静脈アクセスを通じて5 ml / kg / hの連続速度注入(CRI)で提供されます。.常に10分間隔でつま先をつまんで適切な麻酔を確認してください.
10. ポビドンヨードを使用して、胸骨から両顎の角度まで術野を消毒します。次に、術野の滅菌ドレープを行います。
11. 手術中は、50マイクログラム(μg)/ kg / minのCRIでリドカインを使用し、3\u201210μg / kg / hでフェンタニルを使用して鎮痛剤を提供します。.自発的または補助的な換気、および許容性高炭酸ガス血症を適用します。.手術中に少なくとも1回は動脈血ガス分析を行います。
12. 関連する低血圧(平均動脈圧<60mmHg)をノルアドレナリンで治療します。.低体温症(直腸温≤38°C)を予防するには、ヒーティングパッドやヒーティング強制空冷式加温システムを使用します。

2.手術段階 - ステップI

1. 胸骨から顎の角度/喉頭のレベルまでの中央皮膚切開から手術を開始します。メス、手術用ハサミ、鉗子で皮膚と軟部組織を鋭く解剖します。皮下組織と脂肪パッドを鈍的解剖によって内側に分離します。.
2. 胸鎖乳突筋の前上部隆起を左側内側に、マイクロ鉗子と手術用ハサミを使用した鈍的解剖により入ります。
3. 肉眼的には、鈍器調製を行い、左の CCA を迷走神経から遠位に慎重に分離して、さらにマイクロ鉗子と手術用ハサミを使用して喉頭麻痺を回避します (図 1 )。左 CCA の分岐部が術中のランドマークとして機能することに注意してください (図 2 および 図 3A )。以下のすべてのステップでは、軟部組織スプレッダーを使用して手術の視覚化を改善します。
4. 迷走神経からの左遠位CCAの調製と解放が成功した後、パパベリン(40 mg / ml、0.9%等張性塩化ナトリウム溶液で1:1希釈)を局所的に投与します。.マイクロスワブですべての血管セグメントを継続的に保護し、その後、さらにパパベリンを外部から投与します。パパベリンを浸した左CCAを自家筋組織の下に置くと、手術用顕微鏡の光の下で血管が乾燥するのを防ぎます。
5. 手術中の外科医の快適性を最大限に高めながら、サイドを切り替えます。右側で同じ外科的処置を繰り返します。CCAを遠位および近位に、事前定義されたランドマークまで解剖します(顎の角度/喉頭および内頸静脈のレベルでの頸動脈分岐;図 3A,B)。スプレッダーを再度挿入し、前述のようにマイクロスワブとパパベリンを投与します。.
6. 右近位 CCA の結紮の前に、静脈耳カテーテルを介してヘパリン (500 国際単位 (IU)/kg) を全身に注入します。
7. これからは手術用顕微鏡を使ってください。まず、右近位 CCA を 4-0 非吸収性縫合糸で肉眼的に見える近位ランドマークの端に直接結紮して、動脈血管への緊張を回避します。
   1. 次に、最初の4-0結紮糸から遠位に切断した後、得られる動脈ポーチはすべての動物で約3\u20124mmの標準化された長さになることを考慮して、測定用の血管クリップを使用して正確に4\u20125mm遠位に6-0非吸収性結紮糸を適用します（図4A,C)。
8. 6-0 結紮糸を締めた後、一時的な血管クリップ (脳動脈瘤手術で通常使用される) で右 CCA をできるだけ遠位にクランプして、内皮の損傷を回避し、血栓形成を防ぐために洗浄用の長い血管セグメントを作成します (図 4B )。
9. 次に、4-0非吸収性結紮糸の遠位にカットを実行します。動脈ポーチ(図4C)を採取するには、6-0非吸収性結紮糸の遠位に2回目のカットを行います。
10. 動脈ポーチをすべての軟部組織から細心の注意を払って洗浄し、その長さ、幅、深さを測定します(図4C)容器クリップで。それ以上の変更が必要ない場合は、自家動脈グラフトをヘパリン処理溶液(0.9%等張性塩化ナトリウムに500 IU / 100 ml)に入れ、さらに使用するまで室温で保管します。.

3. 動脈嚢の劣化

1. 動脈嚢の劣化が必要な場合は、軟部組織から細心の注意を払って洗浄し、実験当日に室温で5mlのトリスバッファーに溶解した100IUのブタエラスターゼで20分間プレインキュベートしてください。ブラシテクニックは使用しないでください。シェーカーを使用して、動脈ポーチを内腔内および超発光的にインキュベートします。
2. ポーチを0.9%等張性塩化ナトリウムのヘパリン溶液に入れる前に、0.9%等張性塩化ナトリウム溶液の解剖学的鉗子で3分間3回静かに拭き取り、残りのブタエラスターゼを洗い流します。.
3. 必要に応じて、動脈ポーチの内腔をシリコン製のマイクロチューブで開いたままにしておきます。外科的処置全体を通して、左右のCCAを濡れたマイクロパッドで細心の注意を払って保護します。

4. 外科的段階 – ステップII

1. CCAをさらに準備するために、その真下に2つの丸いマイクロスワブを置き、動脈をより表面的に動かします。次に、動脈の視覚化を改善するために、左のCCAの下の遠位3分の1に紫色のパッドが入ったマイクロスワブを1つ置きます。
2. 0.9%等張性塩化ナトリウムと500IUのヘパリンを100 mLの0.9%等張性塩化ナトリウムに溶解させた溶液で、右近位CCAをフラッシュします。.緊張のない吻合を作成するには、手術用ハサミを使用して右側にトンネルを通すことにより、脂肪パッド/気管周囲筋組織の下に右側のCCAを配置します。動脈の軟部組織を取り除きます。
   1. 次に、マイクロハサミと鉗子を使用して、右CCAの近位側で2mmの魚の口の切開を行います。
3. 手術台の側面を変更します。左遠位CCAを別の一時的な血管クリップでクリップし、続いて近位の左CCAを2つの一時的な血管クリップでクリップします。濡れたマイクロスワブを使用して、露出したすべての血管セグメントが手術用光の下で乾燥するのを防ぎます。
4. 左CCAの遠位3分の1を軟部組織から完全に解放し、動脈切開術を行います。外科用マイクロ鉗子を使用して、軟部組織をそっとつかみます。次に、動脈を持ち上げ、手術用顕微鏡はさみで左遠位CCAをゆっくりと切開します。血管セグメントをヘパリン(500 IUを100 mLの0.9%等張性塩化ナトリウム溶液に溶解)で洗い流します。.
5. 湾曲したマイクロ鉗子とマイクロハサミで動脈切開を行った後、左 CCA の遠位 3 分の 1 にある動脈切開術を遠位に拡大し、頸動脈の右鈍器と自家移植片の直径の約 2 倍を測定します。これにより、動脈ポーチに十分な血流が流れ込むことができます。
6. ヘパリン化生理食塩水から動脈ポーチを取り出します。.ポーチを分岐が計画されている手術野に置きます。非吸収性の9-0縫合糸で尾側に位置する右頸動脈鈍部の後部を縫合し始め、続いて魚の口切開部のレベルで頭蓋側に位置する後側を縫合します。後部を遠位から近位までシングルステッチで縫い終えます。
7. 縫合中は、すべてのエラスターゼをインキュベートしたポーチを連続的な灌漑で湿らせてください。ポーチの血管壁を縫合しながら、湾曲した外科用マイクロ鉗子を使用して、その先端で内腔を穏やかに開きます。左または近位右のCCAの一部を縫合するときは、まっすぐな外科用マイクロ鉗子を使用してください。その後、横方向の背面を縫合します。
8. 次に、動脈瘤のドームからその基部に移動するところから始めて、水平な前面を縫合します。その後、表側を遠位に一針縫い、尾側に動かします。
   1. すべてのステップ4.5-4.8について、吻合を縫合する際には、医原性狭窄を避けるために、動脈切開術に近い血管の部分をつかむだけに注意を払います。また、ヘパリン化塩化ナトリウム溶液(500 IUを100 mlの0.9%等張性塩化ナトリウムに溶解)で満たされたシリンジで、外科的処置全体を通じてすべての血管セグメントを照らし続け、湿ったマイクロスワブで保護します。.
   2. 吻合を終える前に、ヘパリン化した0.9%等張性塩化ナトリウム溶液を管腔内(500IUを100mlの0.9%等張性塩化ナトリウムに溶解)で複合体全体を洗浄する。エラスターゼ修飾動脈ポーチは、乾燥して血栓になる傾向が強いため、できるだけ早く縫い付ける必要があることに注意してください。嚢内の残留エラスターゼ濃度が周囲血管の消化に関して攻撃的な挙動を示すため、血管複合体を迅速に再灌流する手術を迅速に進めてください。
9. すべての一時的な血管clを取り外すamps段階的に。
   1. 遠位クランプを左CCAから取り外します。軽度の出血を受け入れ、吻合部にマイクロスワブを優しく刻印してそれを止めます。その後、clを取り外しますamp 右のCCAの、マイクロスワブと鉗子で優しく押して、血栓の形成を防ぎます。
   2. 必要に応じて、一時的な血管クリップを交換して、十分な凝固を提供します。その後、両方のベッセルクリップを左側から近位にリリーフします。いずれかのステップで必要な場合は、クリップを交換して凝固させるか、再ステッチを実行します。
10. この段階で、血管複合体の蛍光血管造影を行います (図 5)
    注: 蛍光血管造影は、2 つのバンドパスフィルター、ビデオカメラ付きスマートフォン、および自転車のスポットライトを使用して、1 ml のフルオレセイン IV を投与することによって行われます。この手順は、すでに他の場所で説明されています20,21,22。
11. 最後に、手術現場を閉じます。吻合を保護するために、単一ノードを備えた3-0再吸収性縫合糸で脂肪パッドを再適応させ、穏やかに縫合します。同じように皮下組織と皮膚を閉じます。

5.術後段階

1. イソフルランと全身鎮痛の投与を中止します 手術の終了時に、嚥下反射が戻ったらすぐに気管抜管を行います。
2. 0.5 mg / kgのメロキシカムIV、10 mg / kgアスピリン(ASS)IV、100 μgのビタミンB12 SC、および20 mg / kgのクラモキシルIVを投与します。.
3. ウサギが自発的に胸骨の横臥を回復するまで、補助的な酸素供給と積極的な加温を提供します。
4. げっ歯類およびウサギの痛みの評価および管理のためのガイドラインに従って、最初の3日間は1日4回の術後のフォローアップおよび動物の世話を行う23,24。
5. 疼痛評価のスコアシートに従って、外耳にフェンタニルパッチ(12μg / h)を塗布し、メロキシカムを1日1回SCで3日間、レスキューセラピーSCとしてメタドンを投与することにより、術後鎮痛を投与します。すべてのウサギに250 IU/kgの低分子ヘパリン(LMH)を3日間皮下投与します。

結果

図1:最初の運用手順。

左頸動脈(白矢印)、迷走神経(黒矢印)(A)、および喉頭麻痺を避けるために左頸動脈を迷走神経から遠位に慎重に分離する様子を描いた最初の手術ステップ。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 非吸収性縫合	B. Braun, Germany	G0762563
6-0 非吸収性縫合	B. Braun, ドイツ	C0766070
9-0 非吸収性縫合	B. Braun, ドイツ	G1111140
Adrenaline	Amino AG	1445419	任意の汎用
Amiodarone	Helvepharm AG	5078567	任意の汎用
麻酔器	Dräger		その他
Aspirin	Sanofi-Aventis (Suisse) SA		622693
Atropine	Labatec Pharma SA	6577083	任意の一般的な
バンドパスフィルター 青	Thorlabs	FD1B	その他
バンドパスフィルター 緑	Thorlabs	FGV9	その他
バイポーラ鉗子			その他
自転車スポット			その他
Biemer vessel clip (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap,スイス	FD560R	一時
バイスペクトル指数 (新生児)			その他
血圧カフ (新生児)			その他<
・グラクソ・スミスクラインAG	758808	任意の<汎用
エバーファーマ	136740-1	任意のジェネリック
心電図 電極			その他
エラスターゼ	シグマ アルドリッチ	45125	任意のジェネリック
エフェドリン	アミノ AG	1435734	任意のジェネリック
Esmolol	OrPha Swiss GmbH	3284044	汎用
フェンタニル(静脈内使用)	Janssen-Cilag AG	98683	任意の一般的な
フェンタニル(経皮)	Mepha Pharma AG	4008286	一般的な
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	汎用
Fragmin	Pfizer PFE Switzerland GmbH	1906725	一般的な
Glyco			任意の一般的な
加熱パッド			その他
等張性塩化ナトリウム溶液(0.9%)	フレゼニウスKABI	336769	ジェネリック
ケタミン	ファイザー	342261	任意のジェネリック
Laboratory shaker	Stuart	SRT6	any other
リドカイン	Streuli Pharma AG	747466	任意の一般的な
Longuettes			他の
Metacam	Boehringer Ingelheim	P7626406	任意の一般的な<
Streuli Pharma AG	1084546	任意の一般的な
マイクロチューブ			その他
マイクロニードルホルダー			その他
ミダゾラム	アコード ヘルスケア AG	7752484	任意の汎用
ニードルホルダー
O2-フェイスマスク			その他
手術顕微鏡	Wild Heerbrugg		その他
Papaverine	Bichsel		任意の一般
Prilocaine-lidocaine crème	Emla		任意の一般
Propofol	B. Braun Medical AG, Switzerland		any generic
パルスオキシメーター			any generic
直腸体温プローブ(新生児)			any other
Ropivacaine	Aspen Pharma Schweiz GmbH	1882249
Scalpell	Swann-Morton	210	その他
小動物のシェーバー			その他
スマートフォン			その他<
		その他
軟部組織スプレッダー			その他
ステンレス製スポンジボウル			<
		その他<
		その他
直線および湾曲したマイクロピンプ			その他
直線および湾曲したマイクロハサミ	その他	直線および湾曲したマイクロハサミ
手術用ドレープ
		その他
手術用ハサミ			その他
注射器 1 ml、2ml、5 ml			その他
Tris-Buffer	Sigma Aldrich	93302	任意の汎用
血管クリップアプリケーター	B. Braun, Germany	FT495T
静脈および動脈カテーテル 22 G			any generic
Vitarubin	Streuli Pharma AG	6847559	any generic
Yasargil titan standard clip (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	一時的

糸 糸 糸 的な 任意の汎用的なライト 的td style='height:14.5pt;'>クラモキシルstyle='height:14.5pt;'>デクスメデトミジン任意の的な任意のもの任意の的な任意のもの任意の任意のtd style='height:15.75pt;'>Methadoneものその他一般的なものなら何でも任意のtd style='height:15.75pt;'>軟部組織鉗子 その他td style='height:15.75pt;'>滅菌マイクロスワブtd style='height:15.75pt;'>聴診器その他