脳腫瘍細胞浸潤のインピーダンスに基づく測定

要約

出典:Mudduluru, G., et.al. インピーダンスに基づくがん細胞の移動と浸潤のリアルタイム測定。J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、膠芽腫細胞の浸潤と移動を測定するためのインピーダンスベースのアッセイを示しています。細胞は細胞外マトリックスを分解し、微多孔質膜を通って移動し、電極に付着してインピーダンスを生成します。このリアルタイム解析は、がん研究アプリケーションに対する彼らの侵襲的な可能性を反映しています。

プロトコル

1. リアルタイム細胞解析システム、細胞浸潤および移動(CIM)プレート、およびめっき用エレクトロポレーションU-118MG細胞の準備

1. リアルタイムのセル解析システムをCO₂実験開始の5〜6時間前に培養条件下でインキュベーターを行い、システムを培養条件に安定させます。
2. インベージョンアッセイでは、CIMプレートの上部チャンバーの各ウェルに0.1 μg/μLの細胞外マトリックス(ECM)ゲルを含むDMEM(プレーン培地)を50 μLプレートします。気泡を避けるために、リバースピペッティング法を使用してください。すぐに30 μLのECMゲルを取り出し、20 μLをウェルに残します。
3. ECMゲルコーティング後、プレートを培養条件下で4時間インキュベーターに保持し、蓋をしておいてください。ECMゲルコーティングおよび乾燥中は、><プレートの上部チャンバーの電極に直接触れないように予防策を講じてください。インキュベーター。
4. インピーダンス測定プログラムを設定するには、関連するソフトウェアアイコンをダブルクリックします（<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Table of Materials)システムソフトウェアアプリケーション(コントロールユニット)を開きます。各クレードルには、実験条件、インピーダンス測定の時間間隔と時間、およびデータ解析を設定するためのさまざまなタブを備えた個別のウィンドウがあります。
5. <スパンの下で style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Layoutタブでは、各生物学的条件に対して四重ウェルを設定し、scheduleタブ。最初のステップは1回限りのベースライン測定(1分間隔で1回のスイープ)で、2番目のステップは実際の実験のためにそれぞれの個々のクレードルの細胞インピーダンスを測定することです。移動には 10 分間隔で 145 回のスイープを使用し、侵攻には 10 分間隔で 577 回のスイープをそれぞれの個々のクレードルで使用します。
6. 細胞インピーダンス測定開始の1時間前に、10% FBSを走化性物質として160 μLのDMEMをプレートの下部チャンバーのウェルに加えます。ECMゲルコーティングされたウェルを含む上部チャンバーまたは下部チャンバーを備えたコーティングされていないウェルのいずれかを組み立てて、それぞれ侵入と移動を測定します。
7. 上部チャンバーのウェルに50 μLの低血清培地を充填し、システムのクレードルに入れます。すべてのウェルがコントロールユニットによって認識されているかどうかを確認するには、Messageタブ。メッセージがOK、クレードルのプレートは実験の準備ができています。
8. インキュベーター内で完全に充填したプレートを、リアルタイム細胞解析システムクレードルで測定する前に、培養条件下で1時間事前にインキュベートします。これは、充填されたプレートを細胞培養条件に順応させるために不可欠です。
9. 低血清培地で処理した細胞を回収するには、培養皿で増殖する細胞を1x PBSで洗浄し、0.05%トリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を2mL加えます。インキュベーターに30秒間置き、トリプシン-EDTAを取り出します。ます style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>low serum medium 15mLチューブに セルを数えます ハンドヘルド自動セルカウンターを使用。
10. カウント後、セルを100 x g5分間待ってから、上澄みを捨ててください。
11. 800,000個の細胞を800 μLの低血清培地に再懸濁して、遊走および浸潤アッセイを行います。さらに、300,000個の細胞を2 mLの培地に再懸濁し、ウェスタンブロット分析のために35 mmディッシュにシードして、CrkおよびCrkLの制御されたノックダウンを確認します。

2. ベースラインの読み取り、セルのシード、セルインピーダンスの測定と視覚化

1. クレードルをクリックしてベースラインの読み取り値を測定してください<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>開始ボタン。ベースラインは、二酸化炭素インキュベーター内の培養条件下でリアルタイム細胞解析システムのクレードルでプレートを1時間事前にインキュベートした後、上部チャンバーのそれぞれのウェルに細胞を播種する前に読み取る必要があります。
   NOTE: ゆりかごStartボタンをクリックすると、制御ユニットは実験ファイルを保存するかどうかを尋ねます。ファイルが保存された後、クレードルアナライザーは、プログラムで最初に設定されたベースラインセルインピーダンスを測定し、クレードルStart ボタンを再度クリックして、2番目のステップでセルインピーダンスを測定します。
2. ベースライン測定後、クレードルから移動と侵入のために両方のプレートを取り出し、バイオセーフティキャビネットに保管します。
3. クレードルの制御ユニットにプログラムされた各ウェルのCIMプレートの上部チャンバー内の各生物学的条件に対して、100μLの細胞(100,000細胞)を四重に播種し、気泡を避けるためにリバースピペッティングにより、クレードルのコントロールユニットで行います。
4. 播種後、プレートをバイオセーフティキャビネットの下に室温で30分間保管し、細胞が底まで均一に落ち着くようにします。プレートをそれぞれのクレードルに戻し、クレードルスタートボタンをクリックして、1.5の2番目のステップでプログラムされたセルインピーダンスの測定を開始します。
5. 最後のスイープの後、実験は終了し、結果は自動的に保存されます。
6. <スパンの下で style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Data Analysisタブでは、実験中または実験完了後に、細胞インピーダンスの変化を細胞インデックスとして時間依存的に視覚化します。四重化の各条件は、個別に、または平均および/または標準偏差として視覚化できますOptions平均と標準偏差のボックス。
7. セルインデックスデータをスプレッドシートファイルにエクスポートするには、空のスプレッドシートファイルを開き、カーソルを<スパンの中央に置きます style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Data Analysis、右クリックします。表示されるダイアログボックスで、オプションを選択しますCopy Data into List Formatして、開いているスプレッドシートにデータを貼り付けます。
8. 生データの時間を調整して、セル・インピーダンス測定の実際の開始時間を表します。2 番目のステップの開始時間は 0 に設定されます。
   NOTE: 制御ユニットは、正規化の有無にかかわらず細胞インデックス(すなわち、正規化された細胞インデックス)を取得し、その結果を時間依存の方法でグラフィカルな表現として視覚化するオプションがあります。この例では、セル インデックス データは、処理とグラフィカル表示のために正規化されずにエクスポートされます。
9. 各クレードルのReleaseボタンをクリックしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIMプレート	Agilent Technologies, Inc.の細胞解析部門	5665825001	細胞侵入と移動プレート
ダルベッコの修正ワシ培地(DMEM)	ATCC	302002	細胞に使用する培地culture
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBSで細胞
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03<
Heracell VIOS 160i 二酸化炭素インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィ	51030285	二酸化炭素インキュベーター
Matrigel	BD Bioscience	354234	細胞外マトリックスゲル
RTCAソフトウェア	アジレントテクノロジーズ社の細胞解析部門		実験に
Scepter	Millipore	C85360	ハンドヘルド自動セルカウンター
トリプシン-EDTA	Gibco	25300-054	<
ATCC	ATCC HTB15	実験に
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc style='width:145pt;'>380601050

を洗浄しますtd style='width:147pt;'> ック使用した機器td style='height:14.5pt;width:153pt;'>U-118MG用いる細胞株