層間流自律システムを用いた層間流圧モデルの開発

要約

出典:Sharma, T. P., et al., Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments.J. Vis. Exp. (2020).

このビデオでは、経層自律システムの眼内圧と頭蓋内圧をシミュレートすることにより、網膜神経節細胞のシグナル伝達に対する層間圧の影響を研究するために人間の目を準備する手順を示しています。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 機器および消耗品の準備と滅菌

1. 必要な消耗品の完全なリスト、およびサプライヤーとカタログ番号については、Table of Materialsを参照してください。
2. 使用する前に、オートクレーブまたはエチレンオキシドアンプルを使用して、すべての機器と器具を滅菌してください。

2. 灌流培地

1. 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL ペニシリン、10,000 μg/mL ストレプトマイシン 0.85% NaCl 中) と 1% L-グルタミン (200 mM) を 1,000 mL 高グルコース ダルベッコ修正イーグル培地 (DMEM) に加えます。
2. 0.22μmのフィルターを通過して灌流培地を滅菌します。

3. トランスラミナー自律システム(TAS)のセットアップ

1. 流入注射器(眼圧(IOP)および頭蓋内圧(ICP)リザーバー)のセットアップ)。
   1. 30 mLの灌流培地(セクション2)を30 mLシリンジに加えます。30mLシリンジに3方向活栓を取り付けます。0.22μmの親水性フィルターを3方向ストップコックに取り付けます。15 G ルアースタブアダプターを 0.22 μm 親水性フィルターに取り付けます。
   2. シリンジのセットアップから気泡を取り除きます。チューブを15Gルアースタブアダプターに取り付けます。通気孔のないユニバーサルロックキャップでストップコックのサイドポートを閉じます。合計 2 回のセットアップを繰り返します。
   3. 1 つのシリンジをチャネル 1 頭蓋内圧 (CH1 ICP) としてラベル付けし、もう 1 つのシリンジをチャネル 2 眼圧 (CH2 IOP) としてラベル付けします。
2. アウトフローシリンジ(IOPおよびICPリザーバー)を設置します。
   1. 30mLシリンジに3方向ストップコックを取り付けます。15 G ルアー スタブ アダプターを 3 ウェイ ストップコックに取り付けます。チューブを15Gルアースタブアダプターに取り付けます。
   2. 通気孔のないユニバーサルロックキャップでストップコックのサイドポートを閉じます。合計 2 回のセットアップを繰り返します。1 つのシリンジに CH1 ICP とラベルを付け、もう 1 つのシリンジに CH2 IOP とラベルを付けます。

4. 全眼球儀の作製

注: 全眼球を受け取った場合は、以下の手順に従って眼の前眼部と後眼部を分離してください。目が二等分されている場合は、手順4.4から開始します。

1. ポビドン-ヨード溶液に目全体を2分間入れます.
2. 無菌リン酸緩衝溶液(PBS)で眼をすすぎ、ポビドン-ヨードを除去します。これを 2 回繰り返します。
3. 鉗子とはさみを使用して、目の球体全体から付属器を取り除きます。赤道で目を二等分して、目の前部と後部を分離します。
4. 視神経鞘を取り外します。後部から硝子体液を取り除きます。
5. 必要に応じて、IOP(下部)チャンバーの丸いドームにしっかりとフィットするように、後部セグメントから追加の強膜をトリミングします。鉗子を使用して、網膜がセグメントの後部に均等に広がっていることを確認します。
6. IOP(下部)チャンバーのセットアップ
   1. 視神経を上部に向けて、丸いドーム上のTASのIOP(下部)チャンバーに人間の後部セグメントを配置します。
   2. エポキシ樹脂製のOリングを4本のネジで後部をシールし、しっかりと密閉します。
   3. チューブをIOP(下部)チャンバーのINポートとOUTポートに挿入します。媒体を含むチューブ付きのIOPインフローシリンジをINポートに挿入し、チューブ付きの空のIOPアウトフローシリンジをOUTポートに挿入します。
   4. プッシュ/プル方式を使用して、灌流媒体を流入ポートにゆっくりと注入して後眼カップを満たし、同時に灌流媒体を流出シリンジからゆっくりと引き出して、ラインから気泡を取り除きます。INチューブとOUTチューブの両方に気泡がなくなったら、メディウムの注入を停止します。
   5. ストップコックをオフの位置にロックします。30 mLシリンジをIOP INポートフィルターアセンブリから取り外し、30 mLの培地を補充します。.次に、シリンジをフィルターアセンブリと交換します。
7. ICP(上)チャンバーのセットアップ
   1. ICP(上)チャンバー/蓋を後部セグメントの背面に置きます。視神経が上部チャンバー内にあることを確認してください。上部チャンバーを4本のネジで密封します。
   2. チューブをICP(上部)チャンバーのINポートとOUTポートに挿入します。媒体を含むチューブ付きICPインフローシリンジをINポートに挿入し、チューブ付き空のICPアウトフローシリンジをOUTポートに挿入します。
   3. メディウムをINポートに穏やかにゆっくりと注入してICPチャンバーを満たし、プッシュ/プル方式を使用してラインから気泡を取り除きます。ICPチャンバーとINチューブとOUTチューブの両方に気泡がなくなったら、メディウムの注入を停止します。
   4. ストップコックをオフの位置にロックします。ポートフィルターアセンブリのICPから30 mLシリンジを取り出し、30 mLの培地を補充します。次に、シリンジをフィルターアセンブリと交換します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#122, 1-1/8" 内側 x 1-5/16" 外側 diam, Viton O-ring, 3/32" thickness, 755 デュロメーター 50 パック	Amazon	B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A デュロメーター, ブラック, 5/8" 内径, 13/16" OD, 3/32" 幅 (100個入り)	Amazon	B000FMYRHK
30 mL 注射器(針なし	Vitality Medical	302832
3ウェイストップコック、メスルアーロック2個、スイベルオスルアーロック、ベントキャップ	QOSINA	2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & 適切なサイズのプラスドライバー	Brikksen Stainless Steel Fastners	PPMSSSCH4C.5<
アンプロレン16大アンプ	フィッシャーサイエンティフィ	NC9085343
Purdue	PUR1815001EACH
コーニング100 x 20mm組織培養処理culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167-100EA	<
Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Curity ガーゼスポンジ、4インチ x 4インチ、12プライ、滅菌済み、1200/CS	Med Plus Medical Supply	COV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated)	Katena	K5-4010
Dumont #5 - Fine Forceps	F.S.T.	11254-20
アイハサミ標準 Curved	Katena	K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes	Capitol Scientific	351058
Fisherbrand 4オンス 標本容器	Fisher Scientific	16-320-730
Fisher Scientific	01-812-54
フィッシャーブランドインスタントシーリング滅菌ポーチ	フィッシャーサイエンティフィ	01-812-55
フィッシャーサイエンティフィ	01-812-58
HyCloneダルベッコの修正イーグルス 中型	フィッシャーサイエンティフィック	SH3024302
HyClone ペニシリンストレプトマイシン 100X ソリューション	Fisher Scientific	SV30010
メスルアーロックインレット、オスルアースリップアウトレット、ブルー&クリア付き親水性フィルター	Qosina	28217
静水圧トランスデューサ、DELTRAN ® II、カタログ# DPT-200、流量3CC/HR	AD機器	DPT-200
JG15-0.5HPX 15ゲージ0.5インチ NTプレミアムシリーズ ディスペンシングチップ 50/Box	Jenson Global	JG15-0.5HPX 15
Keyence B2‐X710 microscope	Keyence	B2-X710
LabChart 8	AD instruments	LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer	Leica	ST5020
QOSINA	65811	<
AD instruments	FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398<
リン酸緩衝液(PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)	AD instruments	PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male	McMAster-Carr	7880T113
Push-to-Connect チューブフィッティング、空気と水用のユニバーサルスレッド、アダプター、1/8インチチューブ外径 x 1/8 パイプ	McMAster-Carr	51235K101
サンゴバンタイゴンS3 E-3603フレキシブルチューブ500フィート	Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
Surgical Hasross - Sharp-Blunt	F.S.T.	14001-14<
組織鉗子 繊細な1x2歯湾曲<	K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS)	ノーステキサス大学健康科学センター	N/A
USA サイズ 030 Oリング Buna-N, B1000, 70 デュロメーター, ブラック, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna)	Marco Rubber & Plastics	B1000-030

)td style='width:174pt;'> ルックtd style='height:15.5pt;width:174pt;'>Betadinetd style='height:15.5pt;width:174pt;'>Corning L-glutamine Solutiontd style='height:31.0pt;width:174pt;'>Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouchesックtd style='height:31.0pt;width:174pt;'>フィッシャーブランドインスタントシーリング滅菌ポーチックtd style='height:15.75pt;width:174pt;'>ノンベントユニバーサルルアーロックキャップ、ホワイトtd style='height:15.75pt;width:174pt;'>Octal Bridge Amp (Model # FE228)td style='width:174pt;'> td style='width:174pt;'> td style='width:174pt;'>Katena