ヒトシナプトソームを用いたミクログリア様細胞の生細胞食作用アッセイ

要約

出典:Funes, S., et.al., Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-Cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes. (ヒトミクログリア様細胞: 誘導多能性幹細胞からの分化およびヒトシナプトソームを使用した In Vitro 生細胞食作用アッセイ).J. Vis. Exp. (2022)

このビデオは、pH感受性蛍光色素標識シナプトソームを使用して、ミクログリア様細胞の食細胞能を研究するアッセイを示しています。

プロトコル

1. 生細胞食作用アッセイ
   1. 20-30 ×^{10 4} PMPsを100 μLのiMG完全培地中の96ウェルプレートにプレート20-30で入れ、10日間分化プロセスに従います。
   2. アッセイ当日、生細胞用の核染色液を2mLのiMG基礎培地に1滴加えて核染色液を調製してください。
   3. 96ウェルプレートのウェルごとに40μLの培地を取り除き、マルチチャンネルピペットを使用して10μLの核染色溶液を加えます。プレートを37°Cおよび5%CO₂で2時間インキュベートします。
   4. ラベル付けされたシナプトソームを氷上で解凍し、水の超音波処理器を使用して1分間静かに超音波処理します。すぐにシナプトソームを氷に戻します。標識シナプトソームをiMG完全培地で、培地50μLあたり1μLのシナプトソームの比率で希釈します。
      注：シナプトソームの濃度はアッセイに依存しており、最適化が必要な場合があります。培地中のDMSOの割合を比較的低く(すなわち、0.1%以下)維持するために、ウェルあたり2μLを超えるシナプトソームを添加しないことが推奨される。
   5. ネガティブコントロールとして、アクチン重合を阻害し、したがって食作用を阻害するために、いくつかのウェルをサイトカラシンDで前処理してください。60 μM サイトカラシン D の溶液を iMG 完全培地で調製します。この溶液を各ウェルに10 μL加えて最終濃度を10 μMにし、37°Cおよび5%CO₂で30分間インキュベートします。
   6. プレートをインキュベーターから取り出し、10°Cで10分間インキュベートします。プレートを氷上に保持し、シナプトソームを含む培地を50μL加えます。
   7. プレートを270 × gで3分間、10°Cで遠心分離し、画像取得までプレートを氷上に保持します。
2. イメージング取得と分析
   1. プレートをライブセルイメージングリーダーに挿入し、分析するウェルを選択します。
   2. 20倍の対物レンズを選択します。
   3. 明視野と青(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール[DAPI])チャンネルのフォーカス、発光ダイオード(LED)の強度、積分時間、ゲインを調整します。シナプトソームの蛍光は、最初の時点では無視できるはずです。明視野チャネルを基準にして、赤 (RFP) チャネルに焦点を合わせます。積分時間とゲインは実験によって異なる場合があります。赤のチャネルには、LED:4、積分時間:250、ゲイン:5の初期設定を使用します。
   4. 各ウェルのモンタージュで取得する個々のタイルの数を選択します（例えば、ウェルの中央で16個のタイルを取得し、それによりウェル全体の面積の約5％をイメージングします)。温度を37°Cに設定し、イメージングに必要な時間間隔を設定します。
      注:この研究では、画像は1〜2時間ごとに最大16時間取得されました。

材料

Software and Equipment

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞培養材料
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning	353872
CellAdhere Laminin-521	STEMCELLTechnology	77004	ラミニンと呼ばれます 521
iMGベースメディアの構成要素
アドバンスドDMEM/F12	Gibco	12634010	最終濃度 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	最終濃度 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	最終濃度 1x
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	最終濃度 100 U/mL
iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	最終濃度 55 μM
IL-34	PeproTech or Biologend	200-34 or 577904	最終濃度 100 ng/mL
iMG base media			最終濃度 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	最終濃度 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	最終濃度 50 ng/mL
食作用アッセイ色素
NucBlue Live Ready reagent	Invitrogen	R37605
pHrodo レッド、スクシンイミジルエステル	ThermoFisher Scientific	P36600	pH感受性色素
その他の細胞培養試薬
Cytochalasin D	Sigma
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 ライブセルイメージングリーダー	Biotek
Gen5 マイクロプレートリーダーおよびイメージャーソフトウェア	Biotek	バージョン3.03

を参照td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>最終濃度 10 μM<td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>