ウェスタンブロッティングによるリン酸化ニューロン塩化カリウム共輸送体2の検出

要約

出典:Josiah, S. S., et al.ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究。 J. Vis. Exp.(2022).

このビデオでは、細胞溶解物中のリン酸化塩化カリウム共輸送体2(KCC2)タンパク質を検出および定量する手順を示しています。このプロセスには、リン酸化KCC2を単離するための免疫沈降と、単離されたタンパク質を定量するための化学発光が含まれます。

プロトコル

1. 細胞培養とトランスフェクション

1. 細胞培養手順の前に、ビーズ浴(37°C)ですべての試薬を温めてください。10%ウシ胎児血清、各1%の2mM L-グルタミン、100x非必須アミノ酸、100 mMピルビン酸ナトリウム、および100単位/mLのペニシリン-ストレプトマイシンを添加した培養培地、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を準備します。
2. 安定してトランスフェクトしたラットKCC2bヒト胚性腎臓293細胞（HEK293^rnKCC2b）をビーズ浴（37°C）で完全に解凍します。クライオバイアルチューブから細胞を5 mLの新鮮な培地が入った遠心チューブに移します。細胞を1200 ×gで3〜5分間回転させます。
3. 吸引器ピペット(真空ポンプに固定)を使用して上清を吸引し、細胞を再懸濁するために10mLの新鮮な培地を加えてください。細胞懸濁液を10cmのディッシュプレートに移します。
4. ディッシュをインキュベーターに入れ、加湿された5%の_CO2雰囲気の中で37°Cで48時間成長させます。インキュベーション期間を監視して、健康な細胞増殖を確保します。インキュベーション期間後に細胞が90%以上のコンフルエントを達成した場合、細胞をさらに分割します。
5. 細胞皿から古い培地を吸引し、2mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかにすすいでください。2mLのトリプシンを加え、室温で約1〜2分間インキュベー
トします。
6. 2mLの完全培地を使用して、皿の中のトリプシン処理された細胞を優しく洗います。9 mLの新鮮な培地を新しい皿に加え、古い皿から1 mLの溶液を新しい皿のそれぞれに加えます。スプリットセルディッシュをインキュベーターに48時間戻して、90%のコンフルエンシーを達成する≥。
7. 細胞をジメチルスルホキシド(DMSO)でコントロールとして、8 μMのスタウロスポリン、または0.5 mM N-エチルマレイミド(NEM)のいずれかで15分間処理してから、溶解バッファーで細胞を回収してください。

2. 細胞溶解物の調製とサンプルのロード

1. 培養皿上の培地を吸引します（トランスフェクション手順から）。細胞培養物を氷の上に置き、氷冷したPBSで細胞を洗浄します。
2. PBSを吸引し、50 mM tris-HCl (pH 7.5)、1 mM エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸 (EGTA)、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、50 mM フッ化ナトリウム、5 mM ピロリン酸ナトリウム、10 mM ナトリウム-β-グリセロリン酸、1 mM オルトバナジン酸ナトリウム、1% (w/v) Triton X-100 を含む 1.0 mL の氷冷溶解バッファーを加えます。 0.27 Mスクロース、1 mMベンザミン、0.1%(v / v)2-メルカプトエタノール、および2 mMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)をディッシュに。
   注:細胞採取中の溶解バッファーの量はディッシュサイズによって異なります。例えば、1 x 10⁷細胞/100 mmディッシュ/150 cm²フラスコあたり1 mLの溶解バッファーが適しており、5 x 10⁶セル/60 mmディッシュ/75 cm²フラスコあたり0.5 mLが適しています。
3. 冷たいプラスチックのセルスクレーパーを使用して、皿の底から細胞をこすり落とし、ピペットを使用して細胞懸濁液をすでに氷上のマイクロ遠心チューブに移します。チューブを4°Cで30分間絶えず攪拌します。
4. 冷遠心分離機(4°C)で細胞溶解物を16,000 x gで20分間回転させ、遠心分離機からチューブを静かに取り出し、氷の上に置きます。上清を予冷した新しいチューブに集め、ペレットを捨てます。
   注:細胞の種類によって遠心分離力と時間を変える必要があるかもしれません。ただし、一般的なガイドラインでは、16,000 x gで20分間遠心分離することを推奨しています。ただし、これは実験ごとに決定する必要があります。例えば、白血球のような繊細な細胞は、非常に軽い遠心分離速度が必要です。

3. 細胞溶解物からの免疫沈降剤の調製

1. ピペットで300μLのタンパク質-G-セファロースを微量遠心チューブに入れます。溶液を500 x gで2分間遠心し、上清を捨てます。
2. 500μLのPBSを加え、溶液をしっかりとボルテックスします。溶液を500 x gで2分間遠心し、上清を捨てます。この手順を繰り返します。
3. 1mgの抗KCC2 Thr906および抗KCC2 Thr1007抗体を200 μLのタンパク質G-セファロースビーズと混合し、PBSで500 μLに容量を合わせます。振動するプラットフォームまたは回転ホイールで4°Cで2時間振とうし、PBSで2回洗浄します。
4. 全細胞ライセートのタンパク質定量を行い、洗浄したビーズに1mgの細胞ライセートを加えてください。エンドツーエンドのローテーターで4°Cで2時間静かにインキュベートし、ビーズをスピンダウンし、150 mM塩化ナトリウム(NaCl)を含むPBSで3回洗浄します。
5. 免疫沈降剤(ビーズ)を200μLのPBSで3回洗浄します。最終ペレットを1xドデシル硫酸リチウム(LDS)サンプルバッファー100 μLに再懸濁します。
6. ローターシェーカーでチューブを室温で5分間振盪し、75°Cの加熱ブロックで10分間インキュベートします。ローディングサンプルを11,000 x gで2分間遠心分離し、上清をゲルローディングに使用します。

4. ウェスタンブロットの実行

1. キャスティング装置を組み立て、新たに準備した8%セパレーションゲル(レシピ/準備は表1を参照)を注ぎ、キャスティンググラスの上部から約2cmのスペースを確保してゲルをキャストします。200 μLの絶対イソプロパノールをセットアップに加え、室温で60分間静置します。
   注：ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)のポリアクリルアミドゲルレシピは、対象タンパク質のサイズによります（表2）によります。したがって、目的のゲルの割合を決定する前に、タンパク質のサイズをメモしてください。
2. ピペットを使用してイソプロパノールを除去し、約200μLの蒸留水でゲルを注意深くすすいでください。新たに調製した6%スタッキングゲル(レシピ/調製については表1を参照)を加えて、キャスティングセットアップの約2cmのスペースを埋めます。ウェルコームにそっとらと収め、室温で30分間放置します。
3. キャストしたゲルを電気泳動タンクに固定します。
4. 30.3 gのトリス塩基、144.1 gのグリシン、10 gのSDSを1000 mLの蒸留水に溶解し、10x転写バッファーを調製します。10 mLの10% SDSと100 mLの10xトランスファーバッファーを890 mLの蒸留水に加えて、1xランニングバッファーを調製します。
5. タンクに1xのランニングバッファを注ぎます。5 μL の分子量マーカーを最初のウェルにロードし、同量のタンパク質を SDS-PAGE ゲルの各ウェルにロードします (使用するコームサイズに応じて 18-30 μL )。空のウェルに1x LDSを充填し、ゲルを120Vで約90〜120分間泳動します。
6. 58.2 gのトリス塩基と29.3 gのグリシンを1000 mLの蒸留水に溶解し、10x転写バッファーを調製します。20%メタノールを含む1xトランスファーバッファーでニトロセルロースメンブレンを活性化します。ゲルとメンブレンを転写バッファーですすぎ、調製スタック上に静かに広げます。
   注:ランニングバッファーとトランスファーバッファーのpHを調整する必要はありません。必要な最適なpHであるべきです。また、これらのバッファーを調製し、実験前に室温で保存して時間を節約することをお勧めします。
7. 移動するサンドイッチを次の順序で配置します：負極（黒枠/端） - サンドイッチフォーム - 濾紙 - すすぎ済みSDS-PAGEゲル - すすぎ済みニトロセルロース膜 - 濾紙 - サンドイッチフォーム - 正極））組み立てたサンドイッチをトランスファータンクに積み重ね、90Vで90分間、または30Vで360分間運転します。

5. 抗体の染色と画像現像

1. 膜を取り外して乾かします。0.1% 1x Tween 20 (1x TBS-T) を含むトリス緩衝生理食塩水中の 5% 脱脂乳から作製したブロッキングバッファーを使用して、メンブレンを室温で 1 時間ブロッキングします。
2. メンブレンを適切な希釈液の一次抗体^8,15,19とβ-アクチン（ローディングコントロール）でブロッキングバッファー内で室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。メンブレンを1x TBS-Tを3回、それぞれ5分間洗浄します。
   注：ベータアクチン、α-チューブリン、またはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ抗体などのローディングコントロールと分離膜をインキュベートすることは、その後の定量中に他のウェスタンブロッティング結果を正常化するためです。各一次抗体の推奨希釈率は、メーカーのマニュアルに記載されています。
3. 洗浄したメンブレンを、ブロッキングバッファーで5000倍に希釈した二次抗体と室温で60分間インキュベートします。再度、メンブレンを1x TBS-Tで3回、それぞれ5分間洗浄します。
   注: 二次抗体は、一次抗体が産生される種に対して産生されることを強くお勧めします。例えば、総KCC2の一次抗体がマウス抗KCC2である場合、抗マウスの二次抗体を使用する必要があります。
4. 洗浄した膜をイメージングボードの上に置きます。各増強化学発光(ECL)試薬を等量混合し、混合溶液をメンブレン上に穏やかに広げてシグナルを発生させます。

6. イメージングシステムとデータ定量化を使用した画像取得

1. イメージングボードをイメージングシステムの適切なコンパートメントに移します。画像処理のために、コンピューター上のイメージングソフトウェアを開きます。
2. ツールバーで「新規プロトコル」をクリックし、「単一チャネル」を選択します。gel imaging/applicationダイアログボックスの下の[Select]をクリックし、[Blot]までスクロールして、[Chemi Hi Sensitivity]または[Chemi Hi Resolution]を選択します。次に、「Signal Accumulation Setup」をクリックして、集録する画像の持続時間と数を設定します。
3. プロトコル設定の下の「位置ゲル」をクリックし、必要に応じてイメージングシステムでゲルを調整します。「プロトコルの実行」をクリックして、イメージを取得します。
4. 画像カタログボックスの下で取得した画像の一つを右クリックして、画像をコンピュータに保存します。目的の画像に移動し、実行ダイアログボックスの下にある[画像を選択して続行]をクリックします。
5. 画像のコントラストとピクセル彩度を調整するために、画像変換アイコンをクリックします。一般ツールバーのスクリーンショットアイコンをクリックして、目的の画像形式に応じて画像をコンピューターに保存します。
6. ImageJソフトウェアを使用してバンド密度を測定し、適切な統計ツールを使用して分析します。

結果

表1：ポリアクリルアミドゲルミックスの作り方（ゲル溶液の分離と積み重ね）のレシピ。

8mL 8% セパレーティングジェル

材料