焼灼誘発性眼圧亢進症後の網膜神経節細胞体腫の定量化

要約

出典:Lani-Louzada, R., et al. げっ歯類の外科的に誘発された緑内障に対する大脳辺縁血管神経叢の全円焼灼。J. Vis. Exp. (2022).

このビデオは、辺縁血管神経叢の全円焼灼を受けた化学的に固定されたラット網膜からの網膜神経節細胞の定量を示しています。このプロセスには、透過化、抗体染色、核対比染色が含まれ、続いて落射蛍光顕微鏡で可視化して、眼圧の上昇が網膜神経節細胞の生存率に与える影響を評価します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.網膜神経節細胞の定量化 somas

注: 次の手順は、脳特異的なホメオボックス/POUドメインタンパク質3A(Brn3a)に対する抗体を用いた網膜フラットマウントの免疫組織化学的染色に基づくRGC体細胞の定量化のためのものです。

1. 孤立した網膜を1mLの1x PBSを含む24ウェル培養プレート(1ウェルにつき1つの網膜)に移し、内側の網膜を上に向けておきましょう。
2. 1x PBS(0.3mL)で0.5%希釈した非イオン性界面活性剤で10分間3回洗浄し、組織を透過化します。次に、非イオン性界面活性剤2%および1x PBS(ブロッキング溶液;0.25 mL)中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)で組織を室温で60分間静かに振とうします。
3. ステップ1.2では、非イオン性界面活性剤0.5%と1x PBSと5%BSAで1:200を希釈してBrn3a一次抗体溶液を調製し、4°Cで保存してください。
4. 60分間の組織ブロッキングの後、0.2mLの一次抗体溶液に網膜を4°Cで72時間、穏やかに振とうしながらインキュベー
トしてください。
5. 組織を1x PBSで10分間3回洗浄し、その後、1:750に希釈した二次抗体溶液0.2mLで室温で2時間インキュベートし、1x PBSと5% BSAでインキュベー
トします。
6. さらに、蛍光核染色のために組織を核対比染色溶液で10分間インキュベートします。免疫組織化学染色は、1x PBS(0.3 mL)を3回繰り返した最終洗浄ステップで終了します。
7. ガラスの顕微鏡スライドに2本の小さなブラシを使用して網膜を転写し、ガラス質面を上に維持します。背側網膜象限を顕微鏡スライドの上に置きます。視神経頭に向かってさらに2つの放射状に切り込みを入れて、他の3つの象限(鼻、腹側、側頭)を区切ります。
   注:カット寸法は固定されていません。それらは、スライド上の網膜の効率的な平坦化を損なうほど短すぎてはならず、視神経孔に到達し、区切られた網膜象限を組織の他の部分から完全に分離するように長すぎないようにする必要があります。
8. 最後に、ガラスのカバースリップに0.2mLの退色防止封入剤を塗布し、これをフラットマウントされた網膜上に置いて組織顕微鏡分析を行います。RGCの密度を推定するには、40x/1.3対物レンズを使用して共焦点落射蛍光顕微鏡でフラットマウントを調べます。
9. 網膜の各象限に対して、8枚の写真を撮ります：中央網膜から2枚(視神経板から~0.9mm)、中央網膜から3枚(視神経板から~2.0mm)、そして周辺網膜から3枚(視神経乳頭から~3.7mm)、合計で網膜ごとに32枚の写真を撮ります。FIJIソフトウェアを使用して、Brn3a陽性細胞をカウントし、平均細胞密度を推定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DAKO	Dako North America	S3023	退色防止実装媒体
LSM 510 Meta	Carl Zeiss	-	共焦点落射蛍光顕微鏡
モノクローナルIgG1マウス抗Brn3a	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a一次抗体溶液
TO-PRO-3	サーモフィッシャーサイエンティフィック	T3605	遠赤色蛍光核対比染色;661 nmでの発光
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	非イオン性界面活性剤
IgGロバ抗マウス抗体+Alexa Fluor 555	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A31570	二次抗体溶液
DAPI	サーモフィッシャーサイエンティフィック	28718-90-3	ジアミジノ-2-フェニルインドール;青色蛍光核対比染色;452±3 nm

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