不整脈に対する感受性を評価するための心内神経系の刺激

要約

出典:Jungen, C., et al.Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、心臓内の神経系を刺激して心臓の不整脈に対する感受性を評価するためのex vivo技術を示しています。灌流装置を用いて、単離されたマウスの心臓に酸素化緩衝液を灌流する。その後、心臓内神経系を高頻度で刺激して不整脈を誘発します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手続きは、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.ランゲンドルフ装置の準備

注:市販のランゲンドルフ灌流システムが使用されます。

1. 修正されたクレブス・ヘンセライト溶液を準備します（119 mMの塩化ナトリウム、25 mMの重炭酸ナトリウム、4.6 mMの塩化カリウム、1.2 mMのリン酸カリウム一塩基性、1.1 mMの硫酸マグネシウム、2.5 mMの塩化カルシウム、8.3 mMのグルコース、および2 mMのピルビン酸ナトリウム)を準備します。カルシウムの沈殿を防ぐには、95%酸素/ 5%二酸化炭素の混合物を灌流溶液に加えます。.0.22μmの細孔サイズでバッファーをろ過します。
2. 必要に応じて、心臓の電気生理学と不整脈形成に対するその効果を調査するために、バッファーに薬理学的物質を追加してください。
3. ウォーターバスを開始し、95%の酸素と5%の二酸化炭素の混合物を含む灌流溶液を入れます。カニューレの直前の灌流液の温度が~37°Cになるように、ウォーターバスの温度を調整します。
4. 正しい温度に達したらすぐにローラーポンプを始動し、装置に灌流溶液を充填してください。
5. 心臓を取り付ける前にポンプ速度を調整し、カニューレを装置に取り付けるときに気泡が残らないようにしてください。

2. ハードおよびソフトウェアの準備

1. デジタルデータ収集システムとそれに対応するソフトウェアをランゲンドルフの装置に接続し、灌流圧力、流量、心拍数を連続的に記録します。
   1. 一般設定の目標灌流圧力を80mmHgに設定してください。
   2. 録音を開始します。
2. 指定されたデジタル刺激発生器によるデータ記録と刺激には、白金電極、電極表面0.5 x 0.5 mm、電極間隔0.5 mmの電気生理学カテーテルを使用してください。
   1. 装置への取り付け後に心臓が配置される領域の近くにカテーテルを配置します。
   2. カテーテルから2つの電極を選択して刺激を準備し、サイクルの長さを100ミリ秒で使用します。

3. 心臓の準備

1. 2つのシャーレ(直径6cmと10cm)とカニューレのあるシャーレに、冷たく(~2 - 4°C)の灌流バッファー(10 - 20 mLと40 - 50 mL、ディッシュ全体が覆われるように)を加え、顕微鏡の真横と顕微鏡の真横の氷の上に置きます。カニューレの周りにダブルノットを準備します。
2. メイヨーハサミと細いパターンの鉗子を使用して胸部を開き、頸部脱臼後の心臓を迅速に切除します。次に、ロンドン鉗子を使用して横隔膜の上の大動脈と大静脈をつかみ、斜視ハサミで脊椎に近いすべての血管と結合組織を切断して心肺ブロックを切除します。
3. 心肺ブロックを氷冷バッファーで満たされた最初の皿(直径6cm)に移し、斜視ハサミとロンドン鉗子を使用して心臓を傷つけることなく慎重に肺を取り除きます。次に、心臓を顕微鏡下に置き、スプリングハサミとデュモンSS鉗子を使用して胸腺、食道、気管を慎重に取り除きます。
4. スプリングハサミを使用して、カテーテルの挿入のために右心房の上部に1.5 - 2 mmの穴を開けます。肺動脈に穴を開けます。次に、大動脈上枝の真下に大動脈を切開し、結び目が簡単に取り付けられるように組織を取り除きます。
5. 左心房の周りの主要な心房に位置する神経節プレキシを含む心房脂肪パッドをそのまま維持するか、慎重に解剖して完全に取り除
いてください。
6. カニューレで心臓を皿に移し、顕微鏡下に置きます。デュモンSS鉗子で大動脈をカニューレの上に引っ張り、準備した結び目を大動脈の周りにしっかりと結びます。カニューレが大動脈の奥深くに配置されすぎないようにして、大動脈弁と冠状血管が空いたまま
になるようにしてください。
7. カニューレをランゲンドルフ装置にすばやく取り付けます。カニューレに気泡が残っていないことを確認してください。
8. 灌流圧力を80 mmHgに切り替えて、一定の圧力の灌流を可能にします。
9. カテーテルを心臓に触れたり傷つけたりすることなく、右心房と右心室に慎重に挿入し、テープでカニューレに取り付けてください。
10. 準備されたサイクル長100ミリ秒で刺激を開始し、最初の20分間の平衡化期間を確保します。
11. 安定した温度を保つためにチャンバーを閉じてください。

4. 電気生理学的パラメータと不整脈発生

1. カテーテルの遠位または近位電極を介して、心房または心室のペーシング閾値の2倍でプログラムされた刺激を適用し、次の手順で説明するように、電気生理学的パラメータを評価します。
   1. span style='background-color:transparent;color:#000000;'>S1S1サイクル長が120ミリ秒、100ミリ秒、80ミリ秒の場合、固定レートペーシングの10秒後の最大リターンサイクル長として、洞ノードの回復時間を決定します。
   2. ヴェンケバッハ点を最長のS1S1サイクル長(8刺激;S1S1: 100 ミリ秒;2 ms stepwise reduction) で、11 個の AV 節伝導が失われます。房室リンパ節の不応期を最長の S1S2 (12 刺激;S1S1: 120 ミリ秒、110 ミリ秒、100 ミリ秒。2 ミリ秒の段階的な S1S2 減少を伴う 1 回の短い結合外部刺激) で、AV リンパ節伝導が失われます。
   3. 最も長いS1S2(12刺激;S1S1: 120 ミリ秒、110 ミリ秒、100 ミリ秒。2 ミリ秒の段階的な S1S2 減少を伴う 1 つの短い結合外部刺激で、心房または心室反応はありません。
2. プログラムされた追加刺激(S1S1:120ミリ秒、100ミリ秒、80ミリ秒、その後最大3回の拍動、60〜20ミリ秒、2ミリ秒の段階的縮小)またはバーストペーシングプロトコル(S1S1での5秒:50〜10ミリ秒、10ミリ秒の段階的減少)を行い、ランベス条約に沿って心室性不整脈の発生を評価します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S3014	修正されたクレブス・ヘンレイトの解決策
炭酸水素ナトリウム	Sigma-Aldrich	401676	修正されたクレブス・ヘンライトの解決策
塩化カリウム	Sigma-Aldrich	P5405	修正されたクレブス・ヘンライト溶液
リン酸カリウム一塩基性	Sigma-Aldrich	P5655	修正されたクレブス・ヘンライトの解決策
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M1880	修正されたクレブス・ヘンライトの解決策
塩化カルシウム二水和物	Sigma-Aldrich	C7902	修正されたクレブス・ヘンライトの解決策
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	修正されたクレブス・ヘンライトの解決策
ピルビン酸ナトリウムbioXtra	Sigma-Aldrich	P8574	修正されたクレブス・ヘンライトの解決策
カルボゲン (95% 酸素 / 5% 二酸化炭素)	SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany		Modified Krebs-Henleit solution
滅菌フィルター steritop-GP 0.22	EMD Millipore	SCGPT05RE	修正されたKrebs-Henleitソリューション
Perfusion system	HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany	73-4343	Langendorff apparatus
カテーテルおよび生理学的パラメータ用のデータ収集システムと対応するソフトウェア	Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand	PL3508 PowerLab 8/35	ランゲンドルフのセットアップ
Octapolar catheter	CIB'ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA	custom	ランゲンドルフのセットアップ
Stimulus generator	STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	STG4002-160μA	刺激設定
Stimulation software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Stimulus II	刺激設定
Plastic Wrap	Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States		消耗品
春のはさみ	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15003-08	ハートの準備
斜視ハサミ	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14575-09	ハートの準備
Mayo Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14110-15	ハートの準備
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11203-25	ハートの準備
London Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11080-02	ハートの準備
Narrow Pattern Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11003-13	ハートの準備