マウスモデルにおける軽度外傷性脳損傷の誘発

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.外科的処置

1. 軽量のアセタール樹脂テーパードポイントイヤーバー、バイトバー、マウス麻酔マスクを使用してマウスを定位固定装置フレームに固定します(図1G、Hを参照)。イソフルランガスは、室内空気中に100〜200mL / minで2%〜3%で供給されます。マウスの呼吸を注意深く監視して麻酔の深さを確保し、必要に応じてガスのレベルを調整します。
2. 角膜の乾燥を防ぐために、滅菌アイローションを目に塗布します。
3. ポビドンヨードスワブと滅菌アルコールパッドで頭皮を3回滅菌します。
4. マウスが深く麻酔されていることを確認するために、つま先をつまむ反応がないことを確認します。
5. メスを使用して、目と首の間の頭皮の正中線を約1cm切開し、頭蓋骨を露出させます(図1Iを参照)。
6. 頭蓋骨を1〜2分間乾かします.
7. ブレグマ(冠状縫合糸と矢状縫合糸の交点)とラムダ(矢状縫合糸とラムドイド縫合糸の交点)を特定します(図1Jを参照)。
   注:マウスの脳地図帳が参考にできます。
8. ヘッドサポート装置を頭の下に置き、マウスの頭の底に押し付けられるまで電球を水で膨らませますが、頭を噛み合わせバーから持ち上げないようにします。
   注: このステップは、閉塞性頭部外傷 (CHI) による耳の問題を減らすために不可欠です。耳のバールによって耳に損傷があり、転がったり出血したりする動物は、研究から排除し、安楽死させる必要があります。
9. インパクターを動物の頭の上の所定の位置に移動します。
10. インパクターを伸ばすには、Extendのトグルスイッチ(インパクターコントロールボックス上)をExtendに配置します。
    注:先端を引っ張って、先端が完全に伸びていることを確認してください。
11. インパクターをブレグマの中央に来るまで並べます (図 1K を参照)。
12. 定位固定装置リーダーのデジタル脳定位固定装置のx座標とy座標を0にリセットします（タッチスクリーンコントロール上)
13. プローブをブレグマからターゲット座標に移動して、プローブを衝撃位置に合わせます：内側-外側= 0.0 mm、前後 = −1.6 mm.
14. 接触センサーを動物の耳にクリップします。
    1. 最初に表面に接触するまで、拡張プローブでプローブの先端をゆっくりと下げます。ビープ音で停止します。
    2. 定位固定装置リーダーのデジタル定位固定装置のz座標を0にリセットします。
15. 先端が頭蓋骨と同じ高さになっているかどうかを注意深く検査します(内側外側および前後面)。
    注:プローブ先端の位置決めは、頭蓋骨の骨折や耳の損傷を防ぐためのこのプロセスの最も重要なステップです。
16. インパクターを引っ込めるには、コントロールボックスのトグルスイッチをリトラクト位置に置きます。先端は引き抜かれ、衝撃の時まで動物の頭と接触しなくなります。
17. 背腹の深さを-1.2mmに調整して、衝撃の深さを設定します。
    注:衝撃の深さは怪我の重症度に影響します。深さは、マウスのさまざまな年齢、体重、および系統に対して、所望の傷害の重症度に力価を測定すべきである。一貫した怪我の重症度を維持するために、深さは時間の経過とともに調整/再調整する必要がある場合があります。重症度は、神経病理学的にはミクログリアと星状細胞 (免疫組織化学 (IHC)) と行動的には、橈骨腕水迷路と能動的回避テストで評価できます。
18. マウスの呼吸を注意深く監視して麻酔の深さを確保し、必要に応じてガスレベルを調整します。
    注:多くの場合、イソフルランガスの割合を下げるか、衝撃の前に10〜20秒間遮断する必要があります。呼吸がわずかに加速するのを注意深く観察してください。衝撃時の呼吸が遅すぎると、動物は無呼吸による衝撃後最初の60秒以内に死亡する可能性があります。これは、衝撃の数秒前に麻酔の深さを調整することで防ぐことができます。
19. 右のトグルスイッチを押すと、impactに衝撃が加わります。プローブの先端は表示された速度で下降し、設定された滞留時間だけ下降したままになり、後退します。
    注:偽マウスはCHIマウスと同じ扱いを受けますが、衝撃は提供されません。
20. CHIインパクトが送られた直後にタイマーをスタートさせて、立ち直り時間(サイドポジションから腹臥位に戻る時間)を記録するか、偽マウスの定位固定フレームからマウスを取り外したときにタイマーを開始します。平均直立反射時間は5-15分です。
    注:正しい直視反射時間は、マウスの緊張と年齢によって異なる場合があります。
21. マウスに目に見える頭蓋骨骨折、出血、無呼吸がないか評価します。陥没した頭蓋骨骨折または目に見える出血のあるマウスを研究から除外します。
    注:頭蓋骨骨折には段階的なレベルがあります。骨が脳組織に圧迫されている点で、減圧された頭蓋骨骨折の動物は安楽死させます(最初にCO₂、副次的な方法として斬首が用いられます)。インパクターの先端が正しくセットされていれば、このような頭蓋骨骨折は非常に稀です。頭蓋骨骨折が発生した場合、より一般的な症状は、頭蓋骨に小さな血滴が付着し、頭蓋骨がわずかに触覚的に荒れることであり、多くの場合、鼻骨の後端を接続する縫合糸に沿っています。これらのマウスは、記録には頭蓋骨骨折の可能性があると記載されていますが、通常は研究から除外されていません。
22. 動物を定位固定装置フレームから取り外します。
23. 皮膚をホチキス止めして頭皮を閉じます。
    注: 吸収性または非吸収性の縫合糸は、ステープルの代わりに頭皮を閉じるために使用できます。
24. 閉じた切開部に滅菌綿の先端のアプリケーターを使用して、トリプル抗生物質軟膏を塗布します。.
25. マウスを清潔な保持ケージに戻して回復します。リカバリーケージの半分は加熱パッド上にあり(低設定)、目覚めているときには熱から離れることができ、意識がないときにも動物の体温を維持することができます(図1Lを参照)。
    注: マウスはリカバリーケージ内で横向きに置かれます。窒息を防ぐために、動物を寝具のない回復ケージに入れるか、ケージに寝具がある場合はティッシュの上に置きます。
26. の「拡張/縮小」の切り替えスイッチをの中心/オフの位置に戻します。
    注:スイッチが延長位置または後退位置のままになっていると、電流は流れ続け、ピストンが膨張します。その後、ピストンが冷えるまでインパクターは機能しません。
27. インパクターをホルダーから取り外し、アイスパックにそっと置きます。
    注: インパクターをアイスパックの上に置いておくと、インパクターの潜在的な膨張を減らすのに役立ちます。
28. 直立反射が発生するまで動物を観察し、直立までの時間を記録します(図1Mを参照)。
    NOTE:右回転反射は、マウスが腹臥位に戻った瞬間と定義されます。ケージは邪魔されずにしておく必要があります。ケージに触れたり、動かしたり、ノイズにさらされたりすると、マウスが直る可能性があります。
29. マウスが目を覚まし、警戒しているときは、マウスを自宅のケージに戻します。通常、怪我をしてから1時間以内に、動物は完全に意識があり、歩き回っています。また、ケージの底に湿った食べ物を追加します。

図1:ステップ1:手術エリアのセットアップ。(A)CHI手術を行うために必要な手術部位とツール(インパクター用アイスパック、インパクターを備えた脳定位固定装置フレーム、インパクターコントロールボックス、手術器具)の一例を示しています。(B)5 mm スチール製プローブの先端、バイトバー、ヘッドサポート装置のクローズアップ図で、正中線の衝撃に必要な位置を示しています。(C)ヘッドサポート装置は、パラフィルムによってチューブに取り付けられた1mLのラテックスピペットバルブから作られています。10mLの注射器に水を入れて球根を膨らませ、ストップコックで球根を膨らませたままにします。(D)インパクターコントロールボックス:(1)衝撃速度を調整するための大きなノブ、(2)ドウェルカウンター、(3)伸縮トグルスイッチ、(4)押し下げると衝撃を与えるトグルスイッチ。(E)使用しないときは、インパクターは過熱や誤動作を防ぐためにアイスパックに保管されます。(F)デジタル定位固定装置ディスプレイは、x(前方-後方)、y(内側-外側)、およびz(背側-腹側)座標を確立するために使用されます。ステップ2: 外科的処置。(G,H)麻酔をかけられ、剃毛されたマウスは、定位固定装置フレーム(I)に固定され、正中線切開が行われ、手術中にインパクターを整列させるために使用される(J)ブレグマ(K)が露出します。ステップ3:の回復。(L)マウスが脳定位固定装置フレームから取り外されます。頭皮をホチキス止めまたは縫合して閉じた後、頭皮を横向きの清潔なリカバリーケージに入れます。(M)マウスは、マウスが転がり、立ち直り反射が発生するまで監視されます。