マウス細動脈内皮におけるカルシウム動態と膜電位変化の解析

要約

出典:Hakim, M. A. et al., Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオでは、マウスの脳から分離された細動脈内皮管の機能解析を実演しています。ベースライン時と薬理学的刺激に対する反応の両方で、細胞内カルシウムレベルと膜電位を測定するための手順を概説しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理によってレビューされ、承認されています。審査委員会。

1.材料と備品

注: 資料表 このプロトコルに必要なすべての試薬と材料用です。また、必要に応じて、各ベンダーのマニュアルやウェブサイトも参照できます。

1. Flow chamber
   1. 陽極酸化アルミニウムで構成されたプラットフォーム上に、ガラスカバースリップ付きの超融合チャンバーを固定します。チャンバー付きのプラットフォームをアルミニウム顕微鏡ステージに固定します。
   2. アルミ顕微鏡ステージのプラットフォーム両端にピンニングピペットを保持したマイクロマニピュレーターをセットします。
      NOTE: 必要に応じて、フローチャンバーユニットを備えた移動可能なステージ装置を使用して、固定された孤立した内皮チューブを1つの顕微鏡装置から別の顕微鏡装置に移動して実験します。
2. 顕微鏡
   1. 防振テーブルの上に倒立顕微鏡（4倍、10倍、20倍、40倍、60倍)を配置して実験装置を設置します。
3. セルラー内V_m 録音機器
   1. 電位計を互換性のあるヘッドステージに接続してください。関数発生器や刺激装置などのアクセサリは、電流注入が必要なプロトコルに使用します。
   2. アンプ出力をデータデジタイザシステム、オシロスコープ、および可聴ベースラインモニタに接続します。基準浴電極(Ag/AgClペレット)をフローチャンバー出口の近くに固定します。
   3. 蛍光システムインターフェース、高強度アークランプと電源、ハイパースイッチ、光電子増倍管(またはPMT)、およびカメラの統合コンポーネントを使用して測光システムを組み立て、[Ca²⁺]_i 内皮細胞内。
   4. 実験全体を通して生理的温度(37°C)を上昇および維持するために、インラインヒーターを備えた温度コントローラーを組み立てます。
   5. バルブコントローラーに接続されたマルチチャンネルプラットフォームをインラインフローコントロールバルブで組み立て、チャンバー内に固定された内皮チューブへの溶液の送達を制御します。
4. マイクロピペットと鋭利な電極
   NOTE: 実験者は、ピン留めを準備するために電子ガラスプラーとマイクロフォージが必要になります。ピペット。
   1. 内皮チューブをスーパーフュージョンチャンバーに固定するには、薄肉のホウケイ酸ガラスキャピラリーから調製した鈍い球形の端部(外径:50-70 μm)を持つ熱研磨ピンニングピペットを準備してください。
   2. V style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>_m、ガラスプーラーのみを使用して、ガラスキャピラリーから先端抵抗が150~150±30MΩの鋭利な電極を準備します。

2. 解決策と薬

1. 生理的塩溶液(PSS)
   1. 140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaClを使用してPSSを最低1 L用意<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂, 1 mM MgCl₂, 10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfon acid (HEPES), and 10 mM glucose.
   2. CaClが不足している必要な解決策を準備してください₂ (Ca ゼロ)²⁺ PSS)は、脳細動脈の解剖と内皮の分離のためチューブ。
      NOTE: すべて準備超高純度脱イオンH style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂O、続いてろ過(0.22μm)。最終製品にpH 7.4が含まれ、浸透圧が290〜300 mOsmであることを確認してください。
2. Fura-2および薬理学的薬剤
   1. ジメチルスルホキシド（DMSO;1 mM)のFura-2 AMストックを準備します。ローディング用のPSSにストック5 μLを添加して、500 μLの作業濃度(10 μM)を調製します。
   2. 必要に応じて、PSSまたはDMSOに少なくとも50mLの薬理学的物質の使用濃度を調製します。.
3. 解決策の実施
   1. KClを脱イオンHに溶解して2M KClを準備します₂O (50 mL of H< に KCl 7.455 g 入 style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂O). 鋭利な電極を埋め戻す前に、0.22μmフィルター付きの注射器に溶液を通してください。

3. 細胞生理学の検査のための細動脈内皮チューブの利用

NOTE: [Ca²⁺ の細胞内記録に使用できます。]_iダイナミクスとV_m 以前に示したように、それぞれ測光とシャープな電極電気生理学を使用します（図 1).[カ²⁺]_i と V_mは、個別の実験変数または組み合わせた実験変数(Figure 1).ただし、細動脈内皮チューブは動脈内皮よりもデリケートであり、実験時間は1時間を超えてはなりません。

1. [Ca²⁺]_i
   1. [Ca²⁺]_i 5-7 mLの流量で連続的な超融合を維持しながら記録します。分。
   2. Ca style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>²⁺染料Fura-2 AMを室温で30分間。細胞をスーパーフュージョン溶液でさらに20〜30分間洗浄し、浴温度を徐々に37°Cに上げます。
   3. 測光ソフトウェアを使用してイメージングウィンドウを手動で調整し、~20個の内皮細胞に焦点を当てます（<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Figure 1A).光がない場合は、蛍光インターフェースでPMTをオンにし、[Ca²⁺]_i Fura-2を340 nmと380 nmで交互に(≥10 Hz)励起し、510 nmで蛍光発光を収集します。一度 [Ca²⁺]_iが確立され、薬理学的薬剤(例:プリン作動性受容体)を適用します。実験的な目標(Figure 1B)に従ってください。
2. Vm
   1. V style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'_m、5〜7mL/minの流速で連続的な超煩合を維持しながら、データ取得速度(≥10Hz)を設定します。浴温度を徐々に37°Cまで上げ、実験が終了するまで維持します。
   2. ホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用して鋭利な電極を引っ張り、2 M KClで埋め戻し、電位計に取り付けられたピペットホルダーで塩化物でコーティングされた銀線にかざして固定し、マイクロマニピュレーターで保持します。
   3. 4倍対物レンズを通して見ながら、マイクロマニピュレーターを使用して、細動脈内皮チューブの細胞のすぐ上に鋭利な電極先端を慎重に配置し、チャンバー内の流れるPSSに配置します。
   4. 倍率を徐々に400倍まで上げ、必要に応じて電極先端の位置を変えます。
   5. マイクロマニピュレータを使用して、鋭利な電極の先端を内皮管の細胞の1つにそっと挿入し、記録を開始します V_m（Figure 1A)。

内皮が休んでいるとき V_m安定しています（−30〜−40 mV)）、所望の薬理学的に適用実験的な目的ごとのエージェント（Figure 1C)。

結果

図1:血流調節に関連する経路の生理学的検査のための内皮チューブの適用。(A)鋭利な電極(紫色の矢印)が、測光用のデータ取得ウィンドウに焦点が合った内皮管の細胞に配置されています。(B)Fura-2測光法を用いたMTA(1 μM)に対する細胞内Ca²⁺の代表的記録。(C)パネルBにおける細胞内^Ca2+トレースと同時に_Vmの代表的記録。(D)蛍光色素で染色した生内皮細胞の原形質膜(緑)と核(赤)の代表画像。(E)蛍光色素で染色した生内皮細胞の原形質膜(緑)と小胞体(ER、赤)の代表的な画像。ERと原形質膜の近接領域はオレンジ色で示されていま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audibleベースラインモニター	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
ホウケイ酸ガラスキャピラリー (ピン留め)	ワーナーインスツルメンツ	G150T-6
ホウケイ酸ガラスキャピラリー (シャープ電極)	ワーナーインスツルメンツ	GC100F-10
BSA: ウシ血清アルブミン	シグマ	A7906
CaCl2: 塩化カルシウム	シグマ	223506
DMSO: ジメチルスルホキシド		Σ D8418
フローコントロールバルブ	ワーナーインスツルメンツ	FR-50
蛍光システムインターフェース、ARCランプ&電源、ハイパースイッチ、PMT	分子デバイス、カリフォルニア州サニーベール、米国	IonOptixシステム
Function Generator	EZ Digital, Seoul, South	Korea FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)	G7021
HCl: Hydrochloric Acid	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Sigma	H4034
インラインソリューションヒーター	Warner Instruments	SH-27B
KCl: 塩化カリウム	Σ	P9541
MgCl2: 塩化マグネシウム	Σ	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
マイクロマニピュレーター	Siskiyou	MX10
マイクロピペットプーラー (デジタル)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
顕微鏡 (ニコン反転)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
顕微鏡対物レンズ	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) および 40X (Plan Fluor)
顕微鏡プラットフォーム (陽極酸化アルミニウム; 直径, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
顕微鏡ステージ (アルミニウム)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
MTA: 2-メチルチオアデノシン二リン酸三ナトリウム塩	Tocris	1624
NaCl: 塩化ナトリウム	Σ	S7653
NaOH: 水酸化ナトリウム	Σ	S8045
オシロスコープ	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
位相コントラスト対物レンズ	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi2000 & 2000-C
シリンジフィルター (0.22 μm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)	Warner Instruments	TC-344B or C
Valve Control System	Warner Instruments	VC-6
防振テーブル	技術製造、ピーボディ、マサチューセッツ州、米国	Micro-g