慢性てんかん誘発ラットにおける興奮性神経伝達物質レベルの評価

要約

出典:Soukupová, M., et al.自由に動くラットの脳波記録中の興奮性アミノ酸の微小透析。J. Vis. Exp. (2018)

このビデオは、慢性てんかん導入のラットにおける細胞外興奮性神経伝達物質レベルの評価を示しています。マイクロダイアリシスプローブを脳に埋め込み、脳波計(EEG)で発作がないことを確認した後、てんかんラットの神経伝達物質レベルの上昇を評価するために細胞外液を採取します。次に、ニューロンの興奮性を維持し、神経伝達物質の放出の増加を引き起こすために高カリウム溶液を注入し、興奮性神経伝達物質のカリウム誘発ピークを評価するためにサンプルを採取します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によってレビューされています。

このプロトコルは、てんかんおよび非てんかんラットの微小透析セッションのEEG制御下で得られたラット脳透析液のグルタミン酸およびアスパラギン酸の測定のために特別に調整されています。ここで説明する資料の多くは、彼の研究室で脳波記録やマイクロダイアリシスに使用しているものと簡単に交換できます。

1.マイクロダイアリシスプローブ電極デバイスの組み立て

1. 3チャンネルの2ツイスト電極(登録電極の切断長が20mm以上、接地電極の長さが10cm以上)を使用し、ガイドカニューレに結合してデバイスを準備します。図1A-1Bの透析用3チャンネル電極とガイドカニューレの例を参照してください。
2. 金属製のガイドカニューレを使用前に数回取り外して挿入(図1D)し、動物のマイクロダイアリシスプローブのスイッチの瞬間に取り外しを容易にするために、ダミーのプラスチックカニュー
レに挿入します。
3. 見当合わせ電極の撚り線を2回曲げ(図1E-1F)、ガイドのダミーカニューレに合わせ、電極先端(図1G)をガイドカニューレ先端(図1H)より0.5mm長く切開します(図1H)。
4. 長さ1 mmのシリコンサークレット(外径2 mm、厚さ0.3 mm、図1I)を準備し、ピンセットを使用してガイドカニューレの先端とねじれた電極の先端をシリコンサークレットに挿入します(図1J)。ガイドカニューレ台座の足に、ラピッドアクションのポリマー接着剤または樹脂で固定します(図1K)。図 1L と図 2A の完成したデバイスの例を参照してください。
5. 殺菌UV光の下でデバイスを4時間滅菌します。デバイスを4回裏返して、各側面が1時間光にさらされるようにします
   注:多くの自家製電極とマイクロダイアリシスプローブは、同様の方法で組み立てることができます。ラット用の上記のインプラントの頭部は、以下の寸法を有する:幅7mm×奥行き5mm×上部から台座のつま先までの長さ10mm;インプラントチップの長さは約11mm、直径は600μmで、すべてのデバイスの重量は約330〜360mgです。(i)次の使用のために手術中に十分な長さの接地電極が頭蓋骨に残され、(ii)動物が殺された場合、およびデバイスが歯科用セメントと共に回収され、セメントが機械的に分解され得るようにアセトンで一晩放置される場合、デバイスは2回または3回再利用されてもよい。 そして、デバイスを洗浄して再度滅菌しました。

2. 脳定位固定装置

手術 無菌手術と

1. 痛みのない手術の現代的な基準に従って、デバイスの埋め込みには、脳定位固定装置とプローブクリップホルダー（図2B）を使用してください。
   1. 成体のSprague-Dawleyラットをケタミン/キシラジン混合物(43 mg / kgおよび7 mg / kg、i.p.)で麻酔し、定位固定装置フレームに固定します。.イソフルラン麻酔(空気中で1.4%、1.2 mL /分)を最初のケタミン/キシラジン注射に追加して、麻酔の深さを時間内に制御できるようにします。.動物の頭の毛皮を剃ります。
2. ヨウ素ベースの溶液で頭部の皮膚表面を綿棒で拭き、続いて70%エタノールで無菌手術の準備をします。
   1. 次の座標を使用して、優先的に準備されたガイドカニューレ電極デバイスを右腹側海馬に埋め込みます：ノーズバー+ 5.0 mm、A – 3.4 mm、L + 4.5 mm、P + 6.5 mmをブレグマに注入します。定位固定術の標準的な技術に従ってください。
   2. 固定ネジを覆わないようにしてください。定位固定装置に取り付けるときは、ガイドカニューレヘッド用の装置をつかんでください。これはプローブホルダーに簡単に位置合わせできる場合があります。
3. 少なくとも4本のステンレス製ネジで頭蓋骨にデバイスを固定します(左骨プレートに1本、右前頭骨プレートに1本、左頭頂骨プレートに1本、頭頂骨プレートに1本)。ティッシュ接着剤を一滴加えて、各ネジを頭蓋骨にさらに固定します。
   1. ねじ山の半分をメタクリルセメントで覆います。接着力を高めるために骨に浅い溝を作ることにより、セメントの結合を促進します。
4. デバイスの先端が脳組織に配置されたら、接地電極のワイヤーを3本の固定ネジの周りにねじります。取り付けられているすべてのネジとデバイスを歯科用セメントで覆います。
5. 手術中および手術後約1時間、直立してケージの周りを移動するまで動物を監視します。低体温症を避けるために、温めパッドの上に置いてください。デバイスの移植後、ラットが少なくとも7日間回復するのを待ちます。
6. 手術後3日間は、少なくとも1日1回、動物に痛みや苦痛の兆候がないか監視します。抗生物質クリーム(ゲンタマイシン0.1%)を切開部位の近くに投与して感染を防ぎ、鎮痛剤(トラマドール5 mg / kg、腹腔内[i.p.])を3日間投与して術後の痛みを防ぎます。.

3.ピロカルピンによる側頭葉てんかんの誘発と実験グループへの動物の割り当て

1. 術後回復の1週間後、動物をグループにランダムに割り当てます:(i)ビヒクルを受け取る対照動物と(ii)ピロカルピンを受け取るてんかん動物。てんかん患者群には、ピロカルピンを投与したすべてのラットが病気を発症するわけではないため、比例してより多くの動物を使用してください。.
2. メチルスコポラミン (1 mg/kg、皮下 [s.c.]) を注射し、その 30 分後にピロカルピン (350 mg/kg、i.p.) を 1 回注射しててんかん重積状態 (SE) を誘発します。メチルスコポラミンとビヒクル(生理食塩水)を対照ラットに注射します。すべてのi.p.投与には、25G針付きの1mLシリンジを使用してください。.
   動物
   1. が行動発作を起こす(5分以内にビブリッサを動かし、うなずき、手足をクローン化する)と、25分以内に全身(SE)を継続的にクローン化する動物を視覚的に確認してください。
3. ジアゼパム(20 mg / kg、i.p.)の投与により、発症から2時間後にSEを停止し、死亡率が約25%、平均潜伏期間が約10日になります。.ピロカルピン注射の直後に始まる発作行動を観察して記録し、その後少なくとも6時間継続します。.
4. 25G針とショ糖溶液(1 mL、os [p.o.]あたり1 mL)1 mLシリンジを使用して動物に生理食塩水(1 mL、i.p.)を投与し、SE後2〜3日間、体重減少の回復を促進します。
   ピ
   1. ロカルピンSE後の最初の1週間以内に初期体重を達成しなかった動物を研究から除外してください（ただし、SEの24時間後に死亡した急性群は例外で、体重の追跡調査が不可能な場合を除く)。
5. SE後の動物を異なる実験群にランダムに割り当てます(図3):急性期(SEの24時間後にマイクロダイアリシスが行われる)、潜伏期(SEの7〜9日後)、最初の自然発作(SEの約11日後)、および慢性期(SEの約22〜24日後、つまり最初の発作の約10日後に開始します)。自然発作の発生について動物を監視します.
   注:てんかんラットでのさらなる実験には、次の包含/除外基準を使用してください:ピロカルピン投与後1時間以内に痙攣性SEの発症;SE後の最初の週の体重増加と、マイクロダイアリシスプローブと電極の正しい位置決め。

4. てんかん行動のモニタリングと分析

1. てんかん行動の長期モニタリング
   ピ
   1. ロカルピン投与の約6時間後(つまり、研究者による直接観察の終了時)に、動物を清潔なホームケージに入れ、24時間のビデオモニタリングを開始します。
   2. デジタルビデオ監視システムを使用して、5日目まで24時間のビデオ監視を続けます。
   3. 5日目から、自宅の長方形ケージのラットをつながれたEEG記録システムに接続し、24時間のビデオモニタリングを続けます。
   4. ファラデーケージの外側に配置されたアンプでパラメータを設定し(各動物のEEG信号の特異性に応じて各チャネルに増幅係数を設定します)、未接続のケーブルによって生成されたEEG信号を観察してEEG取得を開始します。サンプリングレートは200Hzで、ローパスフィルターは0.5Hzに設定します。
   5. 片方の手で伸ばした2本の指の間に動物の頭を固定するケーブルに動物を接続し、もう一方の空いている手でコネクタを電極台座にねじ込みます。アクイジションを開始します。
      注意:信号にアーティファクトがないことを確認してください。一般的なアーティファクトは、スケールを大幅に超えるスパイクです。
   6. マイクロダイアリシス実験の前日に、マイクロダイアリシス用のプレキシガラスボンベを装備したテザーEEGシステムに動物を移します。動物をホームケージのEEGテザリングシステムから切り離し、動物を拘束せずに電極からコネクタをねじ込みます。動物をハイプレキシガラスシリンダーに入れます。
2. マイクロダイアリシスセッションの前日とセッション中のてんかん行動のモニタリング
   1. ファラデーケージの外側に配置されたアンプをオンにします。EEGソフトウェアを開きます。未接続のケーブルから生成されるEEG信号を観察して、EEG取得を開始します。
   2. 動物をテザードEEG記録システムに接続し、片方の手で伸ばした2本の指の間に動物の頭を保持し、もう一方の空いている手でコネクタを電極台座にねじ込みます。脳波信号がスケールに収まるように、単一の動物の電極信号に応じて、増幅器の各チャネルに増幅率(ゲイン)を設定します。研究者の直接観察の下で、動物に新しいケージ(シリンダー)を少なくとも1時間探索させます。
   3. 注:マイクロダイアリシス実験の24時間前に、ラットはガイドカニューレをマイクロダイアリシスプローブに切り替えるためにイソフルランで短時間麻酔されます。麻酔をかけられた瞬間を利用して、脳波記録システムに接続します。
   4. 動物の商品に応じて振り子ケーブルを短くまたは延長します。ケーブルが動物の動きや横たわる姿勢を妨げないように注意してください。
   5. ビデオカメラの正しい画像フレーミングを確認します。ビデオEEG記録を開始します。
3. 発作と脳波活動の識別
   1. ビデオを見るためにソフトウェアプレーヤーを使用してください。リアルタイム再生の8倍の速さでムービーをスクロールし、全身性発作を個別化します(前肢クローナスで動物を育てる動物または前肢クローナスで動物を育てて落下する動物を参照)。ビデオの速度を落とし、行動発作の開始と終了の正確な時間に注意してください。
   2. ビデオレコードの 24 時間で観察された全般性発作の数をカウントしてデータを処理し、発作の頻度と期間を 24 時間に観察されたすべての発作の平均値として表します。
   3. EEG 発作を、ベースラインよりも >3 倍の振幅増加を特徴とする高周波 (>5 Hz) の発作性活動の期間として定義し、スパイク周波数が最低 3 秒またはそれに匹敵するほど進行します。EEGソフトウェアを使用して、生のEEG記録を処理します。EEGトレースを1時間分数に分割します。EEGトレースフラクションをファイルにコピーして、ソフトウェアの自動スパイク分析を行います。
   4. EEGソフトウェアと事前定義されたパラメータを使用して、EEGアクティビティデータを分析します(4.3.3。分析された動物のグループを知らない2人の独立した研究者ですべてのビデオ分析を実施します。意見が食い違っている場合は、一緒にデータを再調査してもらい、コンセンサスを得ます。

5. マイクロダイアリシス

1. In vitroプローブの回収
   1. 製造元の指示に従ってプローブを最初の使用に備え、保護スリーブで取り扱います。
   2. 実験を3回に分けて実施します:1.5 mL試験管を3本調製し、標準試料(グルタミン酸2.5 μM、アスパラギン酸2.5 μM)の混合物を含む1 mLのリンゲル溶液を充填します。37°Cに設定されたブロックヒーターに3本の装填された1.5mL試験管を入れ、スターラー上に配置します.
      注:クロマトグラフィーのキャリブレーションには同じ標準溶液を使用してください。
   3. 1.5mLの試験管をパラフィンフィルムで密封し、鋭利なピンセットで穴を開けて直径約1mmの穴を開けます。
   4. プローブを取り、パラフィンフィルムで開けた穴に挿入します。メンブレンを溶液レベルより少なくとも2mm浸します。さらに、プローブをパラフィンフィルムで1.5mL試験管に固定します.
      注意:先端が1.5mL試験管の壁に触れないようにしてください。
   5. フッ素化エチレンプロピレン(FEP)-チューブとチューブアダプターを使用して、プローブインレットを輸液ポンプに取り付けられたシリンジに接続します。必要に応じて、内径0.28mm(ID)と外径0.61mm(OD)の細口径ポリエチレンチューブと、接続に色付きのチューブアダプター(赤と青のチューブアダプター)を使用します。
   6. ポンプを2μL / minで始動し、液体が出口先端に現れるようにします。FEPチューブとチューブアダプターを使用して、プローブアウトレットを0.2mL収集試験管に接続します
      注:すべての接続にはFEPチューブを使用してください。かみそりの刃を使用して、チューブの希望の長さをカットします。プローブの入口と出口に異なる色のチューブアダプターを使用してください。ポンプを60分間作動させます。漏れや気泡がないか確認してください。これらは存在しないでください。
   7. ポンプを流量2μL / minに設定し、チューブの出口側でサンプルの収集を開始します。
   8. 30分間の灌流液サンプル3個と溶液の等量サンプル3個を1.5 mL試験管に集めます。1.5 mL試験管の標準溶液に浸漬したマイクロシリンジを使用して、1.5 mL試験管から等量のサンプルを30分ごとに採取します。
   9. 実験(5.1.1-5.1.8)を繰り返し、ポンプを流量3μL / min(5.1.7)に設定して、2つの異なる灌流流量を使用した場合のプローブの回復率を比較します。
   10. 終了したら、ポンプを停止し、蒸留水、70%エタノールでチューブをすすぎ、空気をチューブに押し込みます。プローブは、きれいな蒸留水で満たされたバイアルに保管します。保存する前に、蒸留水でプローブを2 μL/minで灌流してプローブを十分にすすいでください。
   11. サンプル中のグルタミン酸とアスパラギン酸の濃度をクロマトグラフィーで分析します。
   12. 次の式を使用して回収率を計算します:
       回復率(%)=(C_灌流液/ C_透析液)x 100。
2. 自由に動くラットでのマイクロダイアリシスセッション
   1. 準備手順：プローブの挿入とテスト、輸液ポンプの設定と開始
      1. メーカーのユーザーズガイドに従ってマイクロダイアリシスプローブを初回使用のために準備し、リンガーの溶液で満たしてください。長さ約10cmのFEPチューブを切断し、さまざまな色のチューブアダプターを使用してプローブの入口と出口のカニューレに接続します。
      2. チューブがアダプターに接触し、すべての接続にデッドスペースがないことを確認してください。
      3. マイクロダイアリシス実験の24時間前に、イソフルラン(空気中5%)で動物をインダクションチャンバー内で短時間麻酔します。ピンセットを使用して、動物の頭をしっかりと保持し、ダミーのカニューレをガイドから取り外します。透析膜が与えられた微小透析プローブをガイドカニューレに挿入し、粘土をモデル化してガイドに挿入された微小透析カニューレをさらに固めます。
         注意:抽出するときは、プローブが保護プローブスリーブの壁に触れないようにしてください。
      4. 動物をプレキシガラスのシリンダーに入れて、新しい雰囲気を探検させます。上記のように、動物をつながれたEEG記録システムに接続します(ポイント4.2.2および4.2.3に従ってください)。
      5. 起きて自由に動くラットの動きを追跡し、チューブアダプターを使用して、プローブの入口をリンゲル溶液を含む鈍い22G針で2.5mLシリンジに接続します。Ringerの溶液をプローブ内に押し込み、10秒で1mLのRingerの溶液を排出し、2.5mLシリンジのピストンを連続的に押します。コンセントに液体の滴が現れていないか確認してください。これで、プローブを使用する準備が整いました。
      6. FEPチューブアダプターに接続された2.5mLシリンジにリンガー溶液を充填し、輸液ポンプに取り付けます。ポンプを2μL/minで始動します。
         注:すべてのFEPチューブの希望の長さを使用しますが、チューブのデッドボリュームを計算して、高K ⁺刺激をいつ開始するかを知り、定量化データを動物の脳の神経化学的変化と関連付けます。作業フローの下のチューブに生成された気泡を使用して、この時間を計算します。
   2. 脳波記録およびカリウム刺激中のサンプル採取
      1. サンプル採取の開始前の3時間に発作がなかったことを確認し、マイクロダイアリシス中の発作活動を引き続き監視してください。
      2. Ringerの溶液で満たされたFEPチューブカニューレシリンジを運ぶポンプを停止します。FEPチューブに接続された2.5mLシリンジの別のセットをポンプに取り付け、チューブアダプターに100 mM K ⁺溶液を含む改質リンガー溶液を充填します。
      3. ポンプを2μL / minで始動し、作動させます。チューブをより迅速に充填するには、充填時間でポンプを5μL / minに設定します。システムに気泡がないことを確認します。チューブがアダプターに接触し、すべての接続にデッドスペースがないことを確認します。
      4. 上記のように動物で使用する準備ができている場合は、プローブをテストします(5.2.1.5)。
      5. 注意: 何らかの理由でプローブが機能しない場合は、プローブを交換してください。このような場合は、準備したマイクロダイアリシスプローブをいくつか、マイクロダイアリシスEEGワークステーションの近くで使用できる状態にしておいてください。動物をEEGケーブルから外し、必要に応じてイソフルランで短時間麻酔して変化を実現します。
      6. リンゲル溶液を充填したシリンジのFEPチューブを各動物のプローブの入口カニューレに接続し、出口の先端に液滴が現れるのを待ちます。
      7. プローブの出口をFEPチューブに接続すると、試験管に収集されます。穴あきキャップ付きの閉じた0.2mL試験管にFEPチューブを挿入します。モデリング粘土で固定して、チューブが所定の位置に留まるようにします。
      8. システムを平衡化するためのサンプルを収集せずに、ポンプを2 μL/minで60分間運転し続けます(サンプルゼロ)。
      9. ベースライン条件下で、5つの連続した30分間透析液サンプル(それぞれ容量60μL)を収集します(通常のリンゲル溶液による灌流)。サンプルを氷上に保存します。
      10. 液体がポンプから動物の頭部を通過するのにかかる時間を計算し(チューブのデッドボリューム、つまり気泡時間によって異なります)、この時点でポンプを停止せずに、通常のリンゲル溶液を含むシリンジから修飾(100 mM K ⁺)リンゲル溶液を含むシリンジにFEPチューブを切り替えます。システムに気泡がないことを確認します。ポンプを10分間作動させます 注意:10分間の高K⁺刺激では、動物は激しく動く傾向があり、通常は大量の濡れた犬の揺さぶり(制御および発作クラスター動物)または行動発作(てんかん動物)を示しますので、チューブとケーブルをねじれから保護するために介入する準備をしてください。
      11. 10分後、チューブを100 mM K⁺リンゲル溶液を含むシリンジから通常のリンゲル溶液に切り替え、ポンプを作動させます。溶液の変更中は、ラインで接続されるチューブの端に液体が一滴垂れるように、ポンプをオフにしないでください。
      12. 透析液に高カリウムが含まれている瞬間から、すなわち、5回目の平衡後透析液を採取した後、10分(20μL)ごとに透析液画分を1時間採取し、さらに30分間の透析液サンプルを3個採取し、ポンプを停止します。サンプルを氷上に保存します。
      13. 実験後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析までサンプルを-80°Cで保存します。
      14. 急性発作群(24時間)と初回発作群を除き、マイクロダイアリシス実験を3日間連続して繰り返します。ただし、SEの24時間後または最初の自然発作の24時間以内にマイクロダイアリシスセッションが1回のみ行われます(図3)。

結果

Figure 1.埋め込むデバイスの段階的な準備。(A)左側の保護スリーブに長さ10cmの接地電極を備えた3チャンネル電極、右側のマイクロダイアリシス用ガイドカニューレはデバイスの組み立てに必要なものです。(B)むき出しの電極とガイドカニューレの詳細。最初のステップは、金属製のガイドカニューレをプラスチックダミーから数回取り外して挿入(D)し、動物の頭に埋め込まれたカニューレの解放を容易にすることです。2番目のステップは、ねじれたレジスター電極を2倍曲げて透析ガイドカニューレ(E、F)に位置合わせ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-channel two-twisted electrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
guide cannula	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	MAB 4.15.IC	Material
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	ソリューション
Xylazine	Sigma, Milano, Italy	X1251	Material
Isoflurane-Vet	Merial, Toulouse, France	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadol	Formevet, Milano, Italy	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine	MSD Italia, Roma, Italy	20891077 (AIC)	Material
simplex rapid dental cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement	松風, 京都, 日本	PN1167	Material
probe clip holder	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	p/n 100 5001	Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam	Roche, Monza, Italy	019995063 (AIC)	Material
1 mL syringe with 25G needle	Vetrotecnica, Padova, Italy	3	Material
ラットフレキシブルフィーディングニードル 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
デジタルビデオ監視システム	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	Equipment
microdialysis probe	Agn Tho's, Lindigö Sweden	MAB 4.15.1.Cu	Material
microdialysis probe	Synaptech, Colorado米国コロラド州スプリングス	S-8010	Material
block heater	Grant Instruments, Cambridge, England	QBD2	Equipment
stirrer	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	Equipment
輸液ポンプ	Univentor, Zejtun, Malta	864	Equipment
ファインボアポリエチレンチューブ	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Material
blue チューブアダプター	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1002	Material
red チューブアダプター	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1003	Material
2.5 mL シリンジ 22G ニードル付き	Chemil, Padova, Italy	S02G22	Material
vial cap	Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic	VCA-1004TB-100	Material
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	Material
ガラスインサート 底スプリング付き	Supelco, Sigma, Milano, Italy	27400-U	Material
autosampler vial	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy	C4013-2	Material
Smartline manager 5000 システムコントローラーおよび脱気ユニット	Knauer, Berlin, Germany	V7602	Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump	Knauer, Berlin, Germany	V7603	Equipment
リンガー溶液	のmMの組成：MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
modified Ringer solution	composition in mM：MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
生理食塩水	0.9% NaCl, pH 7.0に調整		Solution
スクロース溶液		水

蒸留溶液中の10%スクロース