ALSマウスモデルにおけるプレチスモグラフィーと筋電図の同時記録

要約

出典:Jensen, V. N., et al.神経筋疾患のマウスモデルにおける呼吸筋活動と換気の反復測定。J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、自由に動くALSマウスモデルでプレチスモグラフィーと筋電図の信号を同時に記録する方法を実演しています。この手順では、埋め込まれた電極と送信機を使用して筋肉活動を捕捉し、呼吸パターンを監視するためのプレチスモグラフィーチャンバーを使用して、ALSマウスの副筋肉の役割を調査します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医学審査委員会によって審査されています。

1. 手術

1. のためのマウスの準備移植用のマウス(すなわち、SOD1(G93A)またはコントロール)を選択し、動物の体重を量ります。
   注：この手術を受けるマウス(オスまたはメス)の推奨年齢と体重は、それぞれP56 - P120と≥24 gです。
2. 酸素流量2L/minで3.5%イソフルラン以下のマウスを麻酔します。つま先つまみと尻尾つまみを行って、マウスが完全に麻酔されていることを確認します。
3. 麻酔をかけたら、ドロップボックスからマウスを取り外し、イソフルランレベルを1.5%に、酸素流量を1L/minに設定して鼻円錐形を介して麻酔を維持してください。つま先をつまむか、尻尾をつまむか、または麻酔が維持されていることを確認してください。
4. 手術中に目が乾燥するのを防ぐために、潤滑剤眼科用軟膏を塗布してください。
5. マウスを剃って、耳と肩の間の手術部位を露出させます（図1C）。
6. マウスがリードを引き抜いたり、治癒過程で引っ掻いて傷を負う可能性を減らすために、足の爪を手術部位に同端にクリップします。
7. 手術部位を交互に拭き取り、まず消毒剤を使用し、次にイソプロパノールを使用します。さらに2回繰り返します。

2. スケーレンと僧帽筋電図(EMG)の活動を記録するためのテレメトリーデバイスの埋め込み

1. 動物を解剖顕微鏡の下に置き、加熱パッドを覆う滅菌パッドの上に横向きに置き、ノーズコーンをテープで所定の位置に固定します。心臓から発信される心電図(ECG)信号を減らすために、右側を埋め込むのが最善であることに注意してください。
   注：呼吸を監視し、必要に応じてイソフルランレベルを調整して、定期的な呼吸数と適切な麻酔面を維持してください。
2. 前肢を胴体に沿って同側の足に向かって引き寄せます。
   注：この位置は肩甲骨を尾側に移動させ、斜角筋と僧帽筋への外科的アクセスを提供します。
   1. 鈍く湾曲した鉗子を取り、前足を手術部位と同側に保持し、前足を所定の位置にテープで固定します（図1C)。強力な粘着性のサージカルテープを使用して、処置中に足が固定されていることを確認します。
3. 新しい手術用手袋を着用してください。メスを使用して、肩と耳の間に約2cmの長さの斜め切開を行います(図1Cの赤い線)。
4. 両手に1つずつ、2つの#2椎弓切除鉗子を使用して、脂肪パッドを引き戻し、僧帽筋と板状筋を広げて、胸鎖乳突筋と斜角筋を覆う筋膜を露出させます（図1DおよびE)。
5. 淡い胸鎖乳突筋と横隔神経を目印にして、斜角筋を特定します。横隔神経は斜角筋と平行に走っていますが、胸鎖乳突筋は下にあります。斜角筋は、頚椎から僧帽筋の下の肋骨まで斜めに走っています。生体電位リードは、横隔神経に隣接して走る筋肉として識別できる前斜角筋に挿入されます (図 1F および G)。
   注: 注意。この領域は高度に血管新生されており、鎖骨下動脈を切らないように注意する必要があります。横隔神経と腕神経叢の損傷を避けてください。
6. スカンと僧尾筋が特定されたら（図1G)、動物の背中、肩甲骨の間に送信機用の皮下ポケットを作ってください。
   1. <>span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>ティッシュセパレーションハサミを使用してください。鈍い先端を皮膚のすぐ下に挿入し、送信機の幅の約1.25倍のポケット開口部が形成されるまで広げます(図1H)。
      注: 送信機は最小限の抵抗で挿入されるべきですが、ポケットは送信機が勝手に動くほど大きくてはいけません。ポケットが小さすぎると、送信機が皮膚にこすれて炎症を引き起こし、動物が皮膚を引っ掻いたり、リード線を引き抜いたりする可能性があります。ポケットが大きすぎると、漿液腫が形成されたり、送信機が好ましくない位置に移動したりする可能性があります。
7. 温かく滅菌した生理食塩水で洗い流し、送信機を筋肉に対して平らな面で挿入します。送信機を平らにし、ワイヤーがねじれるのではなく互いに平行にポケットから出るように配置します(図1I)。デバイスの下の余分な長さのワイヤーをカールさせ、平らに置きます。
8. 送信機からのリード線を斜角筋と僧帽筋に走らせて、二組のバイポテンシャルリードが互いに平らで平行
になるようにします。
9. 椎弓切除鉗子を使用して前斜角を周囲の筋肉から分離し、斜角筋を通して筋繊維に垂直に25ゲージの針を挿入します。
   1. 針の先端に1本のリード線を挿入し、その後、針を筋肉から引き抜き、ワイヤーの絶縁体まで筋肉に挿入されたリード線を残します（図1JおよびK)。どの色のリード線がどの筋肉に挿入されたかを記録します。
10. リードが挿入されている筋肉に近いワイヤーの露出した端にシアノアクリレート接着剤を少量垂らし、リードキャップと筋肉の間にワイヤーが露出しないように、リードキャップをワイヤー上に素早くスライドさせます（図2AおよびB）。
    注：EMGリードをシアノアクリレートで固定することは受け入れられている方法ですが、別の方法はリードキャップの周りに絹の縫合糸の結び目を結ぶことです。
11. キャップの遠位にある余分なワイヤーをトリミングし、リードキャップ/ワイヤーの端にシアノアクリレート接着剤を一滴塗布します。接着剤が重合する時間を与えてから放出します(図2CおよびD)。
12. 同じ手順（ステップ3.10-3.12）に従って、最初のリード線から1〜2mm離れた同じ筋肉に、最初の極性に平行な逆極性のリード線を挿入してください。
13. ステップ3.10 - 3.12を繰り返して、斜角筋のすぐ前方に位置する僧帽筋にリード線を挿入します（図1LおよびM）。
14. ワイヤーのリード線が所定の位置に固定されていること、そして動物が引っ張らずに体の動きを行うのに十分なたるみがあることを確認してください。余分な長さのリードが皮膚を押さないと、動物がリードを引っ掻いたり引き抜いたりする可能性のある刺激を引き起こす可能性がありますので、注意してください。必要に応じてリード線の位置を変えて、潜在的な不快感を防ぎます。
15. 前肢を押さえているテープをそっと取り除きます。ファットパッドを筋肉の上に引き戻し、挿入されたリード線を覆うために使用します。シアノアクリレート接着剤で切開部を閉じ、皮膚のフラップを元に戻して切開部を閉じ、切開部が揃うようにします。湾曲した鉗子と一緒に皮膚フラップの一部をつまみ、この線に沿ってシアノアクリレート接着剤の小さな線を塗ります。
16. 動物がまだ麻酔下にある間に、術後の痛みを軽減するために0.1mLのカルプロフェンを皮下に注入してください。
    注：手術後1〜2日間は1日1回、その後も必要に応じて0.1mLのカルプロフェンを投与し続けてください。
17. 動物をノーズコーンから取り出し、事前に温めた保育器の清潔なケージに入れ、目を覚ましてケージ内を自発的に動き回るまで入れます。その後、動物をインキュベーターに少なくとも15分間入れ、その動きと警戒度を監視します。

3. 術後のケア

1. 手術後に動物を別々に飼いましょう。癒しの動物にダイエットジェルとウォーターボトルを提供します。
2. 手術後の最初の30分間、動物を監視してください。手術後5時間、少なくとも1時間ごとに動物をチェックしてください。手術後の数日間は、少なくとも毎日2回チェックしてください。
3. 壊死、切開部やインプラントを含む体腔内の感染(熱、腫れ、赤み)、漿液腫の形成を監視してください。
   注：これらの兆候は、手術後1週間以内に発生します。図1Nは、手術後1ヶ月で健康で治癒した動物を示しています。EMG記録は移植直後に行うことができますが、移植直後はECG信号が高くなる可能性があるため、動物はEMGとプレチスモグラフィーを記録する前に治癒するために少なくとも1週間与えられます。

4. 筋電図とプレチスモグラフィー信号

1. を同時に取得するバイアスフローを含むすべての取得機器をオンにします。
   注: マウスの流量は通常1.0 L/minに設定されています。
2. 流量計を使用してプレチスモグラフィーチャンバーを校正します。
   注: プレチスモグラフィーチャンバーを定期的にチェックして、シールが割れたり壊れたりしていないことを確認してください。良好な状態を保つために、ゴムシールには週に一度、真空グリースなどの潤滑剤を塗布してください。
3. 入力送信機のキャリブレーションはメーカーによって指定されています。
4. マウスをプレチスモグラフィーチャンバーに少なくとも1時間置いて、EMGとプレチスモグラフィーを記録する前に順応させてください。複数のチャンバーを使用すると、1つのマウスから記録し、次のマウスが2番目のチャンバーで順応している間に記録することができます。バッテリーの電力を節約するために、順応期間中は送信機の電源を入れないでください(図1O)。
5. 録音前（キャリブレーション後、移植した動物から1インチ以内に強力な磁石を置いて送信機の電源を入れてください。受信機の前面にある赤いライトが送信機がオンであることを示します。
6. 「取得」とラベル付けされたプルダウンメニューを使用して取得を開始し、「取得を開始」を選択してください。記録時間は実験によって異なる場合がありますが、典型的なプレチスモグラフィーとEMGの記録は1〜3時間続きます。
   注:送信機は240Hzの固有のサンプリングレートを持っています。ソフトウェアでは、ポイント間を補間し、より滑らかな波形を提供するために、500 Hz の高速レートが設定されています。インプラントのローパス フィルター (アンチエイリアス フィルターとして機能) とハイパス フィルターは、このテレメトリ デバイスの 1 Hz から 50 Hz の帯域幅を指定します。60 Hz の A/C 干渉は、インプラントがバッテリー駆動であり、動物がインプラントとリードを電界からシールドするため、EMG 信号の過剰なノイズに寄与しません。プレチスモグラフィー、筋電図、ビデオは、取得ソフトウェアを介してリアルタイムで自動的に同期されます。
7. 取得が終了したら、磁石で送信機の電源を切り、動物をチャンバーから取り出してください。

結果

Figure 1.呼吸筋筋電図を測定するためのテレメトリーデバイスの埋め込み (A) 筋電図を測定するための2対の生体電位リードを備えたテレメトリー送信機。リード線は、希望の長さにトリミングするか(下)、コイル状にしてトランスミッタの下に押し込むことができます(上)。(B)送信機のリード線。(B')ワイヤーを露出させ、リー...

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