自家血液注射によるラットモデルにおける大量橋出血の誘発

要約

出典:Tang, X. et.al., 自家血液の二重注射による大量の橋出血。J. Vis. Exp. (2021)

このプロトコルは、大量の橋出血をモデル化するために、ラットの脳の橋領域に自家血液を制御注入するものです。目的は、局所的な圧力を増加させることにより、局所的な脳出血をシミュレートすることです。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物と器具
2. 体重250±10gの8週齢の雄のSprague-Dawleyラットを使用してください。
3. 少なくとも7日前からラットを飼ってください周囲温度25°C、相対湿度65%、12/12時間の明暗サイクルで制御された環境条件下で手術を行います。
4. 食料と水を無制限に提供します。
5. 機器を準備します(図1A-E)。

2.橋に血液を注入

1. 手術の3日前に再度ラットの体重を量り、実験に適した体重のラットを選択します。
2. モデリング前の3日間に、ラットに1日3回平均台の上を歩くように訓練し、正常なラットが一時停止せずに平均台を通過できるようにします。
3. 麻酔前に加熱パッドを37°Cに予熱します。
4. 脳定位固定装置フレームのホルダーにマイクロドリルを取り付けます。
5. ラットに50 mg / kgケタミンと5 mg / kgキシラジンを腹腔内に注射します。.つま先をつまむ反応がなくなるまで待ちます。
6. ラットを腹臥位で脳定位固定装置フレームに運びます。イヤーバーを外耳道の上に置いて、頭を固定します。注射のゆがみを避けるために、頭蓋骨を水平位置に固定します(図1F)。
7. イソフルラン(97.5%酸素と2.5%イソフルラン)によって、入口と出口ポートを備えた定位固定装置用ノーズコーンを介して麻酔を維持します。
8. 角膜を湿らせておくために目の軟膏を使用してください。
9. マイクロシェーバーで頭蓋骨の上の髪を剃ります。
10. 図1Fに示すように、両側外側眼瞼の線から後頭蓋骨の0.5cm後ろまで、頭蓋骨にマーカーペンで3cmの正中線を引きます。
11. Entoiodineサージカルスクラブを、マークされた正中線の中央から外側に回転するように、円形に塗布します。
12. 外科用ドレープを置きます。
13. マークされた正中線に沿ってメスで切開します。
14. 綿棒を使用して、潜在的な血液を取り除きます。
15. 頭皮フラップの両側に鉗子を置き、頭蓋骨を露出させます(図1G)。
16. 綿棒を0.9%生理食塩水に浸し、結合組織がマイクロドリルに引っかかるのを防ぐために、頭蓋骨から結合組織をそっと取り除きます。
17. マーカーペンでブレグマの中心点を原点としてマークします。
18. マイクロドリルを使用して、AP-9.0 mm、Lat 0 mm(Figure 2BおよびTable 1)で開頭術(直径1mm)を行います。この点は静脈洞に非常に近いため、慎重に進めてください (図 1G
19. マイクロドリルを脳定位固定装置フレームから取り外します。
20. 100 μL の Hamilton シリンジを脳定位固定装置ホルダーに入れます (図 1Kインジェクションポンプのスイッチをオンにし、Rapid Inhalationボタンをクリックし、ヘパリン溶液(12500Uを生理食塩水100mLで希釈)を100μLに吸引し、血液凝固が速すぎるのを防ぐために完全に排出します。
21. クロルヘキシジンと75%アルコールの外科用スクラブを尾全体に根元から先端まで少なくとも3回塗布して、皮膚を消毒し、角質を和らげ、尾静脈を拡張して注射の成功率を高めます。
22. 1mLの注射器に頭皮鍼治療を取り付けます。
23. 尾先から3cmの側尾静脈に頭皮鍼を装着し、150μLの血液を採取します(図1H)。
24. 1mLの注射器から頭皮の鍼治療を取り出します。
25. 血液をチューブに移します(図1I)。
    注:血液凝固を防ぐために迅速に転送します。
26. 手術用手袋を交換してください。
27. 引き出しモードを選択し、容量を100 μLに設定し、速度を200 μL/minに設定し、RUNボタンをクリックして、100 μLの血液をハミルトンシリンジに吸引します(図1J)。
28. Infuse モードを選択し、速度を1 μL/minに設定します。
29. 先端が脳の表面から9.2 mm下に達するまでシリンジを進めます(図2Cおよび図1L)。
30. Run ボタンをクリックして、最初の10 μLの血液を1 μL/minの速度で注入します(表1)。
31. 注射を停止し、くも膜下腔に血液が流れ込むのを防ぐために、シリンジを20分間所定の位置に置いておきます。.
32. 先端が脳の表面から9.0mm下に到達するまで、シリンジを引っ込めます。
33. 残りの血液が完全に注入されるまで、1μL /分の同じ速度で注入を再開します。.
34. 血液の逆流を避けるために、シリンジを所定の位置に10分間置いておきます。.
35. シリンジを脳からゆっくりと取り外します。
36. 骨セメントを使用して開頭穴を覆います。
37. セメントが乾いたら、4-0ポリアミド縫合糸フィラメントで傷口を縫合します。3針または4針縫った後、2-1-1の標準的な外科用結び目を結びます。
38. 感染を防ぐために、ラットにペニシリン(0.25 mL、80 IUを4 mL生理食塩水で希釈)を腹腔内に注射します。.
39. ラットに酒石酸ブトルファノール(2.5 mg / kg)を皮下注射し、手術後24時間まで術後の痛みを和らげるために2時間ごとに注射を繰り返します。.
40. ラットが麻酔から完全に回復するまで、15分ごとに観察します。ケージの下に加熱パッドを付けた状態で、元のケージに戻します。犠牲になるまで、ネズミに食べ物と水への自由なアクセスを提供します。

表1:自家血液の注射。

	マイルド	中程度	Massive
総ボリューム	30 μL	60 μL	100 μL
初回注射
定位座標	AP -9.0 mm;ラット0;Vert -9.2 mm
Volume	10 μL	10 μL	}10 μL
速度	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
{{}}{{インターバル時間	20分	20分	20分
2回目の注射
定位座標	AP -9.0 mm;ラット0;垂直 -9.2 mm		AP -9.0 mm;ラット0;Vert -9.0 mm
容量	20 μL	50 μL	90 μL
速度	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
の撤退前針	10分	10分	10分
AP: 前後位置
緯度: 横方向
バート: 縦型

結果

図1:手術の器具と手順。(A)麻酔器。(B)手術器具。(C)マイクロドリル。(D)マイクロインジェクションポンプ。(e)定位固定装置。(F)頭蓋骨の中央に線がマークされています。(G)黄色の矢印はドリルの位置を指しています。(H)尾静脈からの血液の排出。(I) 血液をエッペンドルフチューブに移します。(J)血液をハミルトン注射器に吸引します。.(K)ハミルトンシリンジを頭蓋骨の穴に通します。(L)自家血液の注入プロセス。

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材料

痛みの管理のために目の保護

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100ml 生理食塩水	広東省宜郷	191222201 C1	ヘパリン希釈液
100μl マイクロインジェクター	Shanghai Gaoge		自家血液
1ml 注射器	江蘇省 Zhiyu	20191014	尾静脈
75% アルコール	山東省		ラットテール
粘着テープ	上海金中		Surgicl instruments
動物麻酔システム	RWD	R510-31S-6	麻酔の誘導と維持
平均台	江蘇省西杉<	神経学的欠損スコアの場合
Bone cement	上海新石寺	20180306	Surgicl instruments
ブトルファノール酒石酸塩	江蘇省恒瑞
電気頭蓋ドリル	南京ダーウィンバイオテクノロジー	20180090018	頭蓋骨
EP tube	南通駿宇		Transfer autologous blood
エリスロマイシンアイクリーム	雲南薬局
加熱パッド	Dangerous Jungle	JR01	保温
ヘパリンナトリウム注射	Chengdu Haitong Pharmacal Company	190701	ヘパリン希釈剤
IndoPhors	Guoyao of China		滅菌
Isoflurane	RWD	20080701	麻酔の誘発と維持
マイクロインジェクションポンプ	Baoding Leifu	TFD03-01-C	自家血
針ホルダー	Shanghai Jinzhong	J32020	Surgicl instruments
Penicilin	中国の国<
Q-tips	江西省松河		Surgicl instruments
頭皮の針	江西省紅達	20200313	尾静脈
メス	上海開元	170902	Surgicl instruments
Shearing はさみ	上海金中	Y00040	Surgicl instruments
Stereotaxic apparatus	RWD	900-00001-00<
手術用タオル	Xinxiang Huakangweiica	20070601	Surgicl instruments
縫合針	上海金中		Surgicl instruments
縫合ハサミ	上海金中	J25041	Surgicl instruments
Tissue holding Forceps	上海金中	J31080	Surgicl instruments

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