酸素-グルコース欠乏と再酸素化が細胞間相互作用に及ぼす影響

要約

出典:Alluri, H., et.al.血液脳関門機能障害を研究するためのIn Vitro虚血再灌流損傷モデルとしての酸素-グルコース欠乏と再酸素化。J. Vis. Exp. (2015).

このビデオは、低酸素および栄養不足の状態をシミュレートすることにより、酸素-グルコース欠乏とそれに続く再酸素化がラット脳微小血管内皮細胞(RBMEC)に与える影響を示しています。これらの条件は、ATPの枯渇、細胞内カルシウムの増加、活性酸素種(ROS)の生成を引き起こし、細胞結合タンパク質を分解してストレス線維形成を誘導し、細胞間相互作用を弱めます。

プロトコル

1. 内皮細胞の播種

1.成体のSprague DawleyラットからRBMECの初代培養物を入手(または商業的に入手)してください。

2.ラット脳内皮細胞増殖培地を用いて、100 cmフィブロネクチン(50 μg/ml)コーティングシャーレでRBMECを培養します。合流に達するまで 2 日ごとに媒体を交換します。

3.80〜90%のコンフルエントに達したら、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を渦巻きながら穏やかに洗浄します。次に、細胞を1 mLの温かい0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液にさらし、37°Cに平衡化して分離します。

4。細胞が剥離して分散するまで、細胞を37°Cで2〜5分間インキュベートします。 注: 培養皿をタップして細胞を剥離します。顕微鏡で細胞を観察し、皿の表面から細胞が完全に剥離していることを確認します。

5.トリプシンを中和するために、5 mlの完全培地をペトリ皿に加えます。分離した細胞を含む培地をピペットで取り出し、15 mLの遠心チューブに集めます。

6.内皮細胞を含む培地を220 x gで5分間遠心分離します。

7。上清を吸引し、細胞を含むペレットを保存します。ペレットをピペットで上下に穏やかに混合することにより、3〜5 mlの新鮮なラット脳内皮細胞増殖培地に懸濁します。その後、自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して細胞をカウントします。

{{}}8.細胞懸濁液を、ウェルあたり10,000〜15,000細胞の範囲の播種密度を持つ0.7平方cm/ウェルのプレコート済み8ウェル滅菌チャンバースライドシステム(50 μg / ml)に移します。コンフルエンスに達するまで37°Cで細胞を増殖させます 注: ウェスタンブロットやその他の実験を行うには、実験に応じて10 cmの細胞培養皿または特別な皿で細胞を増殖させることができます。

2.酸素とグルコースの欠乏-再酸素化 In Vitro モデル

1.低酸素細胞培養システムを使用して、RBMECに対するOGD-Rの影響を研究します(図1を参照)。製造元の指示に従って、実験を開始する前に低酸素細胞培養システムをセットアップし、キャリブレーションします。

2.コンフルエントチャンバースライド(ステップ1.8)を37°Cインキュベーターから取り外します。チャンバースライド内の培地全体を脱酸素化されたグルコースを含まないダルベッコ修正イーグルス培地(DMEM)と交換し、95%窒素と5%二酸化炭素を入れた低酸素チャンバーに37°Cで2時間置いて、OGD状態を表します。

3。細胞をインキュベーターに戻し、酸素95%、二酸化炭素5%、37°Cで新鮮なラット脳内皮細胞完全培地を提供し、37°Cでさらに1時間インキュベートします。

注:このステップは、再酸素化の状況を表しています。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM、グルコースなし	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 ウサギポリクローナル抗体	ライフテクノロジーズ	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 ウェル滅菌、 スライドガラス	サーモサイエンティフィック	177402
FITCタグ付き抗ウサギ二次抗体 抗体	サンタクルーズ	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	他のPBSは 使用できます