このビデオは、ネイティブクロマチン免疫沈降法を使用して、マウス脳腫瘍に由来するニューロスフェア細胞からのタンパク質-DNA複合体の単離を示しています。クロマチン調製、免疫沈降、洗浄、およびDNAを放出して下流の分析に供するタンパク質消化の手順について詳しく説明します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
ニューロスフェア細胞のネイティブクロマチン免疫沈降
706 回視聴
⸱
2025年4月28日
この記事について
要約
プロトコル
1. ネイティブクロマチン免疫沈降（ChIP)
- Chromatin preparation
- 由来のニューロスフェア細胞(NS)をストックした後、T-75フラスコの15 mLのNSC培地に15 mLのNSC培地でNSを37°Cで培養し、雰囲気95%の空気と5%のCO2でNSがコンフルエントになるまで培養します。1つのコンフルエントT-75プレートは、3-5 X 106細胞を生成します。
- 細胞がコンフルエントになったら、NSを300 x gで5分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞解離培地1mLを加えてください。細胞を37°Cで5分間インキュベートします。5 mLの培地を加え、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
注:免疫沈降(IP)反応ごとに1 x 106個の細胞が必要です。免疫前血清またはIgGコントロールも含める必要があることに注意してください。 - 1.5 mLの微量遠心チューブ1本でNSを300 x gで5分間遠心分離し、上清をデカントし、NSペレットを1 mLの平衡塩溶液で再懸濁し、懸濁液をタンパク質結合性の低い1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
- NS を 300 x g で 5 分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞ペレットを消化バッファー 95 μL (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM CaCl2, 0.2% ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル) に高濃度 (1:100) のプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した 1 x 106 細胞に再懸濁します。凝集を防ぎ、気泡が発生しないように、すぐに細胞を上下に動かします。
- 50%グリセロール中のミクロコッカスヌクレアーゼ(MNase)を再懸濁して、1 mg/mL溶液(1.15 units/μL、-20 °Cで保存)を作ります。これは「1x」ストックと呼ばれます。50%グリセロール(例:「1x」MNase900μLおよび50%グリセロール100μL)で2回目の1:9希釈を行い、「0.1倍」ストックを作成し、-20°Cで保存します。
- 5 μL の "0.1x" MNase と 145 μL の消化バッファーを混ぜます。酵素は常に氷の上に置いてください。希釈したMNaseを消化バッファーに5 μL加え、1 x 106細胞あたり。チューブをフリックして混合し、チューブを37°Cブロックに正確に12分間置きます。サンプルを一度に1つずつ処理して、12分という正確なインキュベーション時間を確保します。
- 10 μLの10x MNase Stop Buffer (110 mM Tris-HCl, pH 8.0, 55 mM Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)) を1 x 106細胞あたり10 μL追加してください。この時点から、サンプルは氷上に保管する必要があります。
- 110 μL "2x Radioimmunoprecipitation Assay buffer (RIPA) buffer" (280 mM NaCl, 1.8% ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル, 0.2% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS), 0.2% Na-デオキシコール酸, 5 mM エチレングリコール-ビス (β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸 (EGTA); 4 °Cで保存) を追加し、1 x 106細胞あたり高濃度 (1:100) のプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加してください。チューブをフリックして混ぜます。
- チューブを4°C、1700 x gの微量分離機で15分間遠心分離します。上清を新しい通常の1.5mL微量遠心チューブに移し(低タンパク質結合性微量遠心チューブは不要です)、氷上に保存します。ペレットを捨てます。
- Immunoprecipitation (IP)
- プロテインAとプロテインGの磁気ビーズを1:1の比率で混合します。各IPについて、25 μLのビーズを調製します。
- 1 mLのRIPAバッファー(10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% polyethylene glycol octylphenyl ether, 0.1% SDS, 0.1% Na-deoxycholate; 4 °Cで保存)を加えてビーズを洗浄し、低濃度(1:1000)でプロテアーゼ阻害剤を添加してください。
- 磁石を使用してビーズを洗浄液から分離させ、洗浄液をデカントします（約1分)。洗浄手順を2回実行します。
- プロテアーゼ阻害剤を添加したRIPAバッファーを使用して、ビーズを元のボリュームに再懸濁します（1:1000）。
- 必要に応じて、プロテアーゼ阻害剤を添加したRIPAバッファーを使用してクロマチンを希釈し、各IPの容量が100-200 μLになるようにします。クロマチンのIPごとに使用される容量の10%をインプット用に確保してください。
注：例えば、IPごとに200 μLを使用する場合、20 μLの希釈クロマチンをインプット用に予約する必要があります。合計4つのIPの場合、クロマチンの総量を820 μLに希釈する必要があります。 - 入力を準備します。プロテイナーゼK(0.5 mg/mL)を添加したTEバッファー(10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA)100 μLをインプットに加え、インプットを55°Cで1時間インキュベートします。
- 製造元の指示に従ってポリメラーゼ連鎖反応(PCR)精製キットを使用してインプットを精製し、キットに含まれる溶出バッファー50μLで溶出してください。
- マイクロボリューム分光光度計を使用して入力の濃度を測定し、その結果をノートブックに記録します。キットからの溶出バッファーを含むブランク。
注:マウスニューロスフィアでは、各IPに対して約6μgのDNAを使用しました。 - 標準設定を使用して、DNAバイオアナライザーに1μLをロードします。残りは、ダウンストリーム アプリケーションで入力として使用するために格納します。
- すべてのIPに10μLの洗浄したプロテインA&G磁気ビーズを追加し、IPを4°Cで1時間インキュベートします。
注:例えば、3つのIPに30μLのプロテインA&G磁気ビーズを追加します。 - サンプルを磁石の上に置き、ビーズが分離するのを待ちます。以前に決定した量を新しい1.5 mLチューブに移すことにより、クロマチンを分割します。
- 抗体を追加し、蒸発を防ぐためにキャップをプラスチックパラフィンフィルムで包んでください。サンプルを4°Cで一晩インキュベートし、20rpmで回転させます。
注:濃度は、メーカーの推奨に従って経験的に決定されるべきです。 - 翌日、室温、2000 x gのミニ遠心分離機を使用してチューブを10秒間回転させます。次に、各IPに10 μLのビーズを添加し、20 rpmで回転させながら、IPを4°Cで3時間インキュベートします。
- IP Washes and Protein Digestion
- 150 μL のプロテアーゼ阻害剤を添加した RIPA バッファーを各 IP に添加し、IP を 4 °C で 20 rpm 回転させて 5 分間インキュベートします。サンプルを磁気スタンドに置き、磁気ビーズを分離させます。ピペットを使用して上清を取り除きます。この手順を 5 回繰り返します。
- 150 μLの塩化リチウム(LiCl)バッファー(250 mM LiCl、10 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、0.5% NP-40、0.5 % Na-deoxycholate;4 °Cで保存)を低濃度(1:1000)でプロテアーゼ阻害剤を添加した各IPに添加し、20 rpmで5分間回転させて4°CでIPをインキュベートします。サンプルを磁気スタンドに置き、磁気ビーズを分離させます。ピペットを使用して上清を取り除きます。
- 150 μLの冷たいTris-EDTA(TE)(プロテアーゼ阻害剤なし)を加え、サンプルを4°Cでインキュベートし、20 rpmで5分間回転させます。サンプルを磁気スタンドに置き、磁気ビーズを分離させます。ピペットを使用して上清を取り除きます。
- 最終洗浄ステップの後、プロテイナーゼK(0.5 mg/mL)を添加したTEバッファー100 μLにサンプルを再懸濁し、サンプルを55°Cで1時間インキュベー
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Bioanalyzer | |||
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | |||
| C57BL/6 | |||
| 塩化カルシウム | |||
| D-ルシフェリン、カリウム塩 | |||
| DiaMag1.5 magnetic rack | |||
| DiaMag Rotator EU | |||
| DMEM/F-12 | |||
| Dynabeads Protein A | |||
| Dynabeads Protein G | 10003D | ||
| EGF | PeproTech | ||
| エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) | E-4884 | ||
| エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸) (EGTA) | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| FGF | |||
| Forceps | |||
| グリセロール、MBグレード | |||
| HBSS | |||
| Fluriso | |||
| Ivis Spectrum | |||
| Hyqtase | |||
| 塩化リチウム | |||
| 低結合マイクロチューブ | |||
| Microcentrifuge tube | |||
| Micrococcal Nuclease | 各バッチは異なる場合があります。実験と分注に十分な量を購入します。 | ||
| N2 | |||
| Normocin | |||
| NP-40 (Igepal CA-630) | |||
| Kimble Kontes Pellet Pestle | |||
| Protease Inhibitor Cocktail | |||
| Protinase K | |||
| QIAquick PCR Purification Kit | |||
| Scalpel | |||
| 塩化ナトリウム | |||
| デオキシコール酸ナトリウム | |||
| ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | |||
| tris Base | |||
| Triton X-100 | |||
| 標準ミニ遠心分離 | |||
| SZX16 microscope | |||
| Nanodrop One |
