ニューロスフェア細胞のネイティブクロマチン免疫沈降

要約

出典:Mendez, F. M. et al., Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、ネイティブクロマチン免疫沈降法を使用して、マウス脳腫瘍に由来するニューロスフェア細胞からのタンパク質-DNA複合体の単離を示しています。クロマチン調製、免疫沈降、洗浄、およびDNAを放出して下流の分析に供するタンパク質消化の手順について詳しく説明します。

プロトコル

1. ネイティブクロマチン免疫沈降（ChIP)

1. Chromatin preparation
   1. 由来のニューロスフェア細胞(NS)をストックした後、T-75フラスコの15 mLのNSC培地に15 mLのNSC培地でNSを37°Cで培養し、雰囲気95%の空気と5%のCO₂でNSがコンフルエントになるまで培養します。1つのコンフルエントT-75プレートは、3-5 X 10⁶細胞を生成します。
   2. 細胞がコンフルエントになったら、NSを300 x gで5分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞解離培地1mLを加えてください。細胞を37°Cで5分間インキュベートします。5 mLの培地を加え、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, refrigerated	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
塩化カルシウム	aldrich	22350-6	buffer reagent
D-ルシフェリン、カリウム塩	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A 磁気ビーズ
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	0.1% BSAと分量で20μg/mLのストックを準備します。
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	セルの凍結用
FGF	PeproTech	100-18b	0.1% BSAで20μg/mLのストックを準備し、分量してください。
Forceps	ファインサイエンスツール	11008-13	腫瘍の解剖用
グリセロール、MBグレード	EMD- Millipore	356352
HBSS	Gibco	14175-103<
Fluriso	VETone	501017	吸入麻酔薬
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo 光学イメージングシステム
Hyqtase	HyClon	SV3003001	セル デタッチメントメディア
塩化リチウム	Sigma	L8895	buffer reagent
低結合マイクロチューブ	Corning Costar	CLS3207	lowタンパク質結合微量遠心チューブ
Microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	各バッチは異なる場合があります。実験と分注に十分な量を購入します。
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normocin	Invivogen	NOL-36-063<
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	aliquotし、-20°Cで保存してください。
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308<
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA purification kit
Scalpel	ファインサイエンスツール	10007-16	腫瘍の解剖用
塩化ナトリウム	VWR	0241-5KG	buffer 試薬
デオキシコール酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	Sigma	L-4390	bufferreagent
tris Base	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP 151-500<
標準ミニ遠心分離	Fisherbrand	12-006-901	標準ミニ遠心分離機
SZX16 microscope	オリンパス	SZX16	蛍光解剖顕微鏡
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W

td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>balanced salt solutiontd style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>抗菌剤、0.1 mg/mLで使用してください。td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> make 10 mg/mL stock in water; aliquot, and save at -20 °C.td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル機