マウス脳切片における遺伝子発現を検出するための二重蛍光In Situハイブリダイゼーションの実施

要約

出典:Jolly, S., et.al.二重蛍光In Situハイブリダイゼーションと免疫標識を組み合わせて、マウス脳切片における3つの遺伝子の発現を検出します。J. Vis. Exp. (2016).

このビデオでは、ダブル蛍光in situハイブリダイゼーションを使用して、マウス脳切片における2つのRNAターゲットの発現を可視化する様子をご覧いただけます。このプロトコールでは、フルオレセインイソチオシアネートおよびジゴキシゲニンで標識したプローブを使用してRNAを逐次検出し、その後、酵素シグナルを増幅して感度を高めます。結果として得られる蛍光により、組織内の標的RNAの共局在解析が可能になります。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.ハイブリダイゼーション

1. 6 °C洗浄バッファーを調製します:150 mM NaCl、15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x 生理食塩水クエン酸ナトリウム)、50% (v/v) ホルムアミド、0.1% (v/v) Tween-20.
2. MABT緩衝液を調製します:100 mMマレイン酸、150 mM NaCl、0.1%(v / v)Tween-20、pH 7.5。
3. 2つのプローブ(DIG標識およびFITC標識)をハイブリダイゼーションバッファー(DEPC処理脱イオン水、50%(v/v)脱イオンホルムアミド、200 mM NaCl、5 mM EDTA、10 mM Tris-HCl pH 7.5、5 mM NaH₂PO₄、5 mM Na₂HPO₄、 0.01 mg/mL 酵母 tRNA、1× デンハルト溶液、および 10% w/v デキストラン硫酸塩) を 65 °C に予熱し、よく混合します。
4. 約300 μlのハイブリダイゼーション混合物を各スライドに塗布し、オーブンで焼いた (200 °C) カバーガラスで覆い、加湿チャンバーでO/Nを65°Cでインキュベートします。
5. スライドを、事前に温めた洗浄バッファーが入ったCoplinジャーに移します。スライドを65°Cで30分間2回、洗浄バッファーで洗浄します。
6. RTのMABTで10分間スライドを3回洗浄します。

2.FITCプローブの可視化

1. の調製 ISH ブロッキングバッファー:2%ブロッキング試薬と10%の熱不活化ヒツジ血清を含むMABT。
2. オプション:疎水性ペンを使用してスライド上の組織切片の周りに円を描き、必要な抗体溶液の量を減らします。
3. 加湿チャンバー内で、ISHブロッキングバッファーを用いてRTでスライドを1時間インキュベートします。
4. スライドO/Nを4°Cでインキュベートし、ISHブロッキングバッファーで1/500(v/v)に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(POD)標識抗FITC抗体とインキュベートします。
5. スライドをPBSが入ったCoplinジャーに入れ、0.1%(v / v)Tween-20(PBST)を入れます。PBSTで10分間3回洗浄し、毎回新しいPBSTと交換します。
6. 使用直前に、蛍光チラミドを増幅希釈液に100倍に希釈して調製します。この例では、FITC-チラミドを使用します。
7. これをスライドに加え、RTで10分間放置します。
8. スライドをCoplinの瓶に入れ、PBSTで10分間3回洗浄します。

3.DIGプローブの可視化

1. 0 0.1 M Tris- HCl pH 8.2を調製します。
2. スライドをISHブロッキングバッファーとISHブロッキングバッファーで1時間インキュベートします。
3. スライドO/Nを4°Cでインキュベートし、アルカリホスファターゼ(AP)標識抗DIG抗体をISHブロッキングバッファーで1/1,500(v/v)希釈します。
4. MABTで10分間3回洗浄します。
5. 0.1 M Tris-HCl pH 8.2 で RT で 5 分間 2 回洗浄します。
6. 使用直前に、錠剤を 0.1 M Tris pH 8.2 に溶解して Fast Red 溶液を調製します。0.22 μMフィルターで溶液をろ過します。
7. スライドを37°CでFast Red溶液と加湿チャンバー内でインキュベートします。最適な現像にかかる時間は異なるため、蛍光顕微鏡でスライドを定期的にチェックし、沈殿物の形成を監視します。この例では、2〜3時間後に反応を停止します.
8. PBSTで10分間3回洗浄します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ	<
Sigma	S4641	65°C洗浄バッファー
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
熱不活性化羊血清	Sigma	S2263
疎水性ペン	コスモバイオ	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIGAP活用<	11093274910
fast red tablets	Roche	11496549001
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 共焦点顕微鏡	Leica
.22 μM filter	Millex	SLGP033RS
脱イオンホルムアミド	Sigma	F9037	ISH ブロッキングバッファ用
塩化ナトリウム	Sigma	S3014<
塩酸	VWR International	20252.29
リン酸ナトリウム一塩基性 anhydrous	Sigma	S8282
リン酸ナトリウム二塩基性二水和物	Sigma	30435
酵母tRNA	ロシュ	10109495001
50x Denhardtの解決策	Life Technologies	750018
デキストラン硫酸	Sigma	D8906
酢酸ナトリウム	Sigma	S2889
Trizma Base	Sigma	T1503

td style='border-top-style:none;height:15.75pt;width:221pt;'> Sodium citrate用td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:135pt;'>Rochetd style='border-left-style:none;border-top-style:none;'> td style='border-left-style:none;border-top-style:none;'> 塩