サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って行われています。
1.Whole-Mount Immunofluorescence Staining
注:このプロトコルは5日間続き、必要に応じて一晩のインキュベーションで中断することができます。フィブリンゲルを乾燥させないでください。すべてのステップは、特に明記されていない限り、RTで実行されます。
- 染色プロトコルを開始する前に、以下の解決策を準備してください。
- 固定後溶液:等量のアセトンとメタノール(例えば、50mL)を混合して、50:50のアセトン:メタノール溶液を準備します。-20°Cで保存し、染色前日にこの溶液を調製してください。この溶液は-20°Cで保存でき、その後の染色に使用できます。
注: アセトンとメタノールは可燃性で健康に有害であるため、この溶液をヒュームフードで準備してください。 - ブロッキング溶液:まずPBSに15%のFBSを加えて、PBSに15%のウシ胎児血清(FBS)、0.3%のオクチルフェノールエトキシレート溶液を準備します。オクチルフェノールエトキシレートを加え、攪拌して溶解します。4°Cで保存してください。
注:この溶液は、事前に大量に調製し、-20°Cで15mLのアリコートに保存し、染色プロトコルが開始される日に使用する前に解凍することができます。各染色プロトコルには、調製したばかりまたは解凍したばかりのアリコートを使用してください。 - 洗浄液: 0.45%オクチルフェノールエトキシレートを添加したPBS1Lを準備し、4.5mLのオクチルフェノールエトキシレートを995.5mLのPBSに加えます。かき混ぜて溶かします。RTで保管してください。
- ステンレス鋼の四角いヘラを使用して、プレートから液滴を慎重に持ち上げます。まず液滴を端から取り除いてから中心を持ち上げ、1 mLのPBSを含む12ウェルプレートのウェルに移します。
注:このプレート形式で、ポスト固定、洗浄、ブロッキングのステップを実行してください。 - 液滴を氷冷した50:50 acetone:methanol溶液1mLで~1分間後から固定します（液滴の境界が白くなります)。
注：アセトンとメタノールは健康に有害であるため、ヒュームフードでこの手順を実行してください。 - 2mLのPBSで3〜5回の洗浄ですすいでください（水分補給が完了すると、液滴はPBS溶液に沈みます)。
注：、ピペットチップで液滴に触れることは避けてください。なぜなら、後固置後、液滴はプラスチックに粘着するからです。プロトコール全体を通して、液滴を損傷したり完全に破壊したりする可能性があるため、吸着による固着後、抗体、ブロッキング、および洗浄溶液の吸引は避けてください。代わりに、プレートを傾け、500〜5,000μLのピペットを使用して溶液を慎重に取り出します。 - ブロッキング溶液を21,000 x g、4°Cで15分間遠心分離し、破片を除去してください。
注:溶液は遠心分離のために1.5mLチューブに分注することができます。未使用の溶液は4°Cで保存でき、関連するすべての後続のステップに使用できます。 - 液滴を500μLのブロッキング溶液中でRTで2時間インキュベートします。
注：使用するブロッキング溶液の量を減らすために、プレートを支持体上で傾けることができ、わずか300μLの溶液/液滴を使用することができます。 - 一次抗体混合物(少なくとも30 μL/液滴)をブロッキング溶液で適切な希釈で調製し、21,000 x g、4°Cで15分間遠心分離します。
- 丸いヘラを使用して液滴を丸い(U)底の96ウェルプレートに移し、一次抗体混合物の少なくとも30μL/液滴で4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、液滴を2mLの洗浄液/ウェルが入った12ウェルプレートに移し、まず5分間の洗浄を3回行い、次に30分の洗浄を9回行い、その後、30分間の洗浄を9回行います。最後の洗浄(2 mL)を4°Cで一晩放置します。
- 翌日、PBSで3回すすぎ、液滴を丸い(U)底の96ウェルプレートに移します。
- 洗浄中に、ブロッキング溶液中で適切な蛍光色素標識二次抗体混合物(1:500に希釈し、少なくとも30μL/液滴)を調製し、21,000 x g、4°Cで15分間遠心分離してください。
- 丸いヘラを使用して液滴を丸い(U)底の96ウェルプレートに移し、少なくとも30μLの二次抗体混合物と、光から保護されたRTで4時間インキュベートします。
注：その後のすべてのインキュベーションと洗浄ステップを光から守ってください。 - 丸いヘラを使用して、2mLの洗浄液/ウェルを含む12ウェルプレートに液滴を移し、最初に5分間の洗浄を3回行い、次に30分の洗浄を4回すすぎます。最後の洗浄(2 mL)を4°Cで一晩放置します。
- 翌日、ゲルを30分間の洗浄で5回すすぎ、その後PBSで3回すすいでください。最後の洗浄(2 mL)を4°Cで一晩放置します。
- 翌日、丸いヘラを使用して液滴を丸い(U)底の96ウェルプレートに移し、RTで10μg/mLのHoechst核染色(少なくとも30μL/液滴)と30分間インキュベートして核を対比染色します。
注:核対比染色のために4',6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール(DAPI)を添加した封入剤を代わりに使用することができます。その場合、この手順と手順 1.16 はスキップされ、手順 1.17 に直接進みます。 - 丸いヘラを使用して、2mLのPBS/ウェルを含む12ウェルプレートに液滴を移し、PBSで3回すすぎます。
- 次のように液滴を顕微鏡スライドにマウントします：<ol style='list-style-type:decimal;'>
- 正方形の22 mm x 22 mmのカバーガラスの端に速硬化封入剤の狭い層を塗布し、~1分間乾燥させます。この手順は、封入剤の過度の硬化を避けるために、各液滴に対して個別に実行します。
注：このステップは、速硬化性封入剤が健康に有害であるため、ヒュームフード内で行ってください。 - 2mLの脱イオン水が入った12ウェルプレートのウェルに浸して液滴を洗い流し、丸いエッジのスパチュラを使用して顕微鏡スライドに移します。吸収紙の小片を使用して余分な水分を取り除きます。
- 液滴に15μLの非硬化性退色防止封入剤を分注します。
注：、ヘキスト核染色が使用されていない場合は、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む封入剤を使用することができます。 - 速硬化の封入媒体を微細なスライドに向けて、カバーガラスを液滴の上に静かに置き、落ち着かせます。
注：速硬化媒体は微細なスライドに付着し、液滴を所定の位置に保持します。
すべての液滴に対してステップ1.17を繰り返します。各顕微鏡スライドに2つの液滴を取り付けます。スライドをRTで~2時間風乾させ、4°Cで一晩保存してください。スライドが水平に配置され、光から保護されていることを確認してください。光学セクショニング機能と20倍または40倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡または直立した落射蛍光顕微鏡を使用して、染色されたネイティブまたはエンドポイントFTのex vivo培養物を画像化してください。タイル機能を使用して、組織のより広い領域を一度にキャプチャします。