蛍光In Situハイブリダイゼーション後のマウス脳切片におけるニューロンの免疫染色

出典:Baleriola, J., et.al.、高解像度In Situハイブリダイゼーションを使用した脳切片における軸索局在mRNAの検出。 J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、蛍光in situハイブリダイゼーションと抗体染色を使用して、固定マウス海馬スライスのコリン作動性軸索内のmRNAの検出を示しています。蛍光顕微鏡法により、コリン作動性ニューロンにおけるプローブタグ付きmRNAおよびコリンアセチルトランスフェラーゼの空間的局在が明らかになります。

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

FISHアッセイとそれに続く熱誘起抗原/RNAアンマスキングを使用した免疫組織化学
1. 開始する前に、必要なすべての材料を準備してください:
  1. ハイブリダイゼーションオーブンを40°Cに加熱し、オーブンに蒸留水を入れたトレイを置いて加湿環境を作り出します。
  2. スライドボックスを取り、蒸留水に浸したペーパータオルを中に入れて加湿します。次に、スライドボックスをハイブリダイゼーションオーブンに入れます。
  3. プローブ(ネガティブプローブとターゲットプローブの両方)を冷蔵庫から取り出し、ハイブリダイゼーションオーブンで10分間加熱します。
  4. Equilibrate amplification reagents AMP 1-4 (contained in the Fluorescent Multiplex Reagent Kit) at RT.
  5. 抗原賦活化液を調製します: 10 mM クエン酸ナトリウム (pH 6), 0.05% Tween 20. 注: 溶液はRTで無期限に保存でき、将来の染色に使用できます。
  6. 50倍ストック溶液(Fluorescent Multiplex Reagent Kit内)をRNaseフリーまたはDEPC処理水で希釈した1倍洗浄バッファーを調製します。
    注: 1x 洗浄バッファーは、室温で1ヶ月間保存でき、将来の染色に使用できます。50倍の洗浄バッファーが沈殿する可能性があります。その場合は、1x溶液を調製する前に、50x洗浄バッファーを40°Cで10分間加熱します。
2. 100%エタノールからスライドを取り出し、RTで5分間風乾します。
3. 抗原賦活化液50mlが入ったコプリンジャーを準備します。スライドを抗原賦活化液に浸漬し、電子レンジで10分間煮沸します。
  注:または、100mlの回収溶液が入った直径100mmの丸いガラス皿にスライドを水平に置きます。
  1. 1Lのビーカーに蒸留水を入れ、電子レンジに入れます。
    注: マスク解除を行う際に、水は熱を「緩衝」します。
  2. スライドをマイクロ波内の抗原賦活化溶液に入れます。高出力で5分間沸騰させます。サンプルの沸騰が止まった直後に、再び高出力でさらに5分間加熱スライドします。
  3. RTでスライドを冷却します。
    注: 重要なステップ:沸騰時間と手順は、マイクロ波の特性に応じてユーザーが決定する必要があります。沸騰の開始が速いほど、溶液が蒸発する可能性が高くなります。この場合、サンプルを2回以上短時間煮沸して、合計10分のマスキング解除時間を完了することをお勧めします。逆に、中電力または低電力で加熱を行う場合は、マスキング解除を1回10分間行うことができます。しかし、サンプルを合計約10分間連続して沸騰させないと、検出する標的RNAとタンパク質の両方の部分的なマスキングが解除される可能性があります。
4. スライドを1x PBSで3回洗浄します。
5. バックグラウンド染色の評価に使用する脳切片に、dapBプローブセットを2〜3滴 (~100 μl) 加えます。注: dapB プローブセットは細菌の遺伝子を標的としており、哺乳類の RNA を認識してはなりません。
6. 目的のRNAを検出するために使用した脳切片に、ターゲティングプローブセットを2〜3滴加えます。注:マウスの残留物20〜1,381をターゲットとするプローブセットAtf4 mRNAが使用されています。
7. プローブの蒸発を防ぐためにスライドをパラフィルムで覆い、ハイブリダイゼーションオーブン内の加湿スライドボックスに入れ、40°Cで2時間インキュベートします。
  注: オプション: 追加の脳スライスは、マウスPolr2Aを標的とするプローブセットとハイブリダイズし、ポジティブコントロールとして使用することができます。
8. スライドを1倍洗浄バッファーで2分間RTで2回洗浄します。
9. 各脳スライスに2〜3滴の増幅試薬AMP 1-FLを加え、スライドをパラフィルムで覆い、スライドボックスに入れ、ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで30分間インキュベートします。
10. スライドを1倍洗浄バッファーで2分間RTで2回洗浄します。
11. 各脳スライスに2〜3滴の増幅試薬AMP 2-FLを加え、スライドをパラフィルムで覆い、スライドボックスに入れ、ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで15分間インキュベートします。
12. スライドを1倍洗浄バッファーで2回、RTで2分間洗浄します。
13. 各脳スライスに2〜3滴の増幅試薬AMP 3-FLを加え、スライドをパラフィルムで覆い、スライドボックスに入れ、ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで30分間インキュベートします。
14. スライドを1倍洗浄バッファーで2回、RTで2分間洗浄します。
15. 各脳スライスに2〜3滴の増幅試薬AMP 4-FLを加え、スライドをパラフィルムで覆い、スライドボックスに入れ、ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで15分間インキュベートします。
16. スライドを1x洗浄バッファーで室温で2分間2回、1x PBSで2回洗浄します。
17. 3 mg/ml BSA、100 mM グリシン、および 0.25% Triton X-100 in PBS (pH 7.4) を含むブロッキング溶液 100 - 200 μl (またはスライスを完全に覆うのに十分な容量) をスライドに加え、パラフィルムで覆い、RT で 30 分間インキュベートします。
18. ブロッキング溶液で希釈した 100 - 200 μl の抗 ChAT 抗体をスライドに加えます (1/100)。パラフィルムで覆い、4°Cで2日間インキュベートします。脳のスライスが乾かないように注意してください。必要に応じて、インキュベーションの24時間後に抗ChAT抗体溶液を脳切片に再塗布します。
19. スライドを1x PBSで5分間、RTで3回洗浄します。
20. 適切なAlexa標識二次抗体 (、例えば、Alexa-594 donkey anti-goat) をスライドに100 - 200 μl加え、パラフィルムで覆い、RTで1時間インキュベートします。
21. 1x PBSでスライドを3回、5分間洗浄します。RT.
22. スライドを蒸留水で一度洗います。
23. DAPI含有封入剤を使用したスライドの埋込み
24. 蛍光顕微鏡で脳切片を視覚化します。

名前	会社	カタログ番号	コメント
Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
ヒトATF4 mRNA （NM_001675.2）の残基15-1256を対象とするカスタムプローブ	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Negative control probe-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	Probe
ポジティブコントロールプローブ-マウス Polr2A (オプション)	高度な細胞診断	312471	Probe
ヤギポリクローナル抗ChAT抗体	Millipore	AB144P
DAPIを使用したProLong Gold封入剤	Life Technologies	P36935
RNAscope 蛍光マルチプレックス試薬キット(蛍光検出用)	Advanced Cell Diagnostics	320850	in situハイブリダイゼーションキット

蛍光In Situハイブリダイゼーション後のマウス脳切片におけるニューロンの免疫染色

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