出典:Zhang, J., et al.網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的免疫金分析。J. Vis. Exp.(2016年)
このビデオでは、網膜シナプスにおける神経伝達物質受容体の局在を可視化するための電子顕微鏡技術を示しています。網膜切片には、膜結合神経伝達物質受容体を示す網膜神経節細胞が含まれており、コレラ毒素サブユニットB(CTB)で標識されています。マーカーを金ナノ粒子標識抗体で標識し、切片を重金属で対比染色すると、RGC受容体が顕微鏡で可視化されます。
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方法論記事
網膜シナプスにおける神経伝達物質受容体の高解像度イメージング
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2025年4月28日
この記事について
要約
プロトコル
動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1.Retinal Tissue Fixation
- 次の材料とツールを組み立ててください：解剖顕微鏡、非常に細い先端を持つ2つの鉗子、はさみ、セルロースフィルターペーパー、プラスチックピペット、顕微鏡スライド。
- 2.0mlのハロタン(吸入麻酔薬)を使用して閉じた部屋でラットに麻酔をかけます。これらの方法で適切な麻酔を決定します:つま先をつまんだ後の後足の引き出しの欠如、またはまばたき反射の欠如。その後、すぐにギロチンで首を切る。虹彩ハサミで目を取り除き、pH 7.4の0.1 Mリン酸緩衝液(PB)に4%パラホルムアルデヒドを入れたガラス皿に入れます。
- 解剖顕微鏡を使用して、眼球の前面を切り取って角膜を切除します。鉗子子でレンズと硝子体を網膜の内側の表面から取り除きます。
- 網膜がアイカップから分離されるまで、2つの鉗子で強膜を剥離します。
- すぐに網膜を100〜200μmの厚さのストリップに切り取り、pHシフト固定を行います。
- 網膜ストリップを4%パラホルムアルデヒドに0.1 M PBでpH 6.0で20〜30分間固定し、その後、室温(RT)でpH 10.5の4%パラホルムアルデヒドと0.01%グルタルアルデヒドを10〜20分間 固定します。
- 0.15 mM CaCl2 (pH 7.4、4°C) でPBを数回洗浄した後、グリセロールで網膜ストリップを凍結保護します (10%、20%、30%でそれぞれ60分間、その後30%で一晩[O/N]]、凍結置換する前に)。
2. 凍結置換
注:この凍結置換方法は、以前に公開されたプロトコルから変更されています。また、楽器が非常に冷たくなっていることが重要です(手袋を着用してください)。そうしないと、器具に触れたときに組織が部分的に解凍される可能性があります。これらのステップはすべて自動凍結置換(AFS)チャンバー内で行われ、機器がチャンバーの縁より上に移動することは決して許可されません。同様に、AFSで使用されるすべての化学物質を適切に冷却する必要があります。
- 電子顕微鏡(EM)凍結保存装置（CPC）で、液体プロパン中のレチナールストリップを-184°Cで急降下凍結します。細いブラシを使用して、プランジロッドの端にある金属スタブに取り付けられた両面テープの小片にサンプルを置きます(ブラシを使用して余分なバッファーを吸い取ります)。
- ロッドを液体プロパンに突っ込み、約5秒間そのままにしてから、液体窒素(LN2冷却凍結転写容器)で満たされた小さな輸送チャンバーを使用して、自動凍結置換装置(AFS)に移します。
- 凍結したサンプルと器具（鉗子とメス）をAFSに入れた後、チャンバー内の器具を数分間冷却してから組織に触れるか、または器具の先端を数秒間小さな輸送チャンバー(液体窒素（LN2冷却凍結転写容器）)に入れて冷却してください。
- AFSに入ったら、細かいメスを使ってサンプルとテープをスタブから取り出してください。また、これらの手順では、窒素ガス流量制御TF(TFは「LN2気化器のレギュレータ制御」と説明されています)を開いたままにしてください。
- 凍結した組織をフラット埋め込みホルダーに入れる前（つまり、AFSを設定する前）に、透明なプラスチックシートから細い円を切り取り、ホルダーの底に置き、各ウェルの底を裏打ちします。これにより、完成時に重合した試料ブロックを比較的簡単に取り外すことができます。
注:以前は、フラット埋め込みホルダーの代替方法を使用し、ダブルライヒェルト+ゼラチンカプセルを採用していました。 - AFSで次の自動シーケンスを使用してください（機器の用語を使用）T1 = -90°Cで32時間、S1 = 温度を4°C/hrで上昇（11.3時間）、T2 = -45°Cで50時間、S2 = 温度を5°C/hrで上昇（9時間）、T3 = 0°Cで40時間（合計）142.3時間）。タイミングシーケンスを開始する前に、サンプルをAFS(-90°C)に配置するのに2〜4時間かかる場合があります。
- 凍結切片を1.5%酢酸ウラニルにメタノール中で-90°Cで>32時間AFSに浸します。フラットエンベデッドアルミニウムホルダー(3つはAFSに収まる)の7つのウェルのそれぞれに2枚のティッシュ(通常は)を置きます。
- ティッシュ+テープをウェルの酢酸ウラニル/メタノールに入れ、テープから組織を取り除くのが難しすぎる場合は、後で埋め込み培地（Lowicryl HM20など)の浸潤を開始する直前にテープを剥がしてください。
- 次に、温度を段階的に-45°C(+4°C/hr;自動シーケンスで)まで上げます。
- あらかじめ冷却したメタノールでサンプルを3回洗浄します。先端の細いプラスチックピペットを使用して各フラット埋め込みホルダーから古い溶液を取り出し、次に別の標準的なプラスチックピペットを使用して予冷した新鮮なメタノールを追加します。
- 次に、同じ方法を使用して、埋め込み媒体などの低温包埋樹脂をサンプルに徐々に浸透させます（HM20/メタノールを1:1と2:1でそれぞれ2時間、続いて純粋な樹脂を2時間使用した後、樹脂を交換してO/Nを維持します)。
- 翌日再び樹脂を交換し、樹脂のレベルをウェルの上端までだけ達するように調整してください。
- サンプル（自動順で-45°C〜0°C、+5°C/hr）を紫外線(UV)で40時間重合します。
- 次に、AFSからサンプルを削除します。通常、サンプル ブロックの色にはまだピンク色が見られます。サンプルを化学ヒュームフード内の蛍光灯の近くに、RT O / N以上で完全に透明になるまで置きます。
3. EM Immunogold Immunocytochemistry
- のポストエンベッド1 μmの切片をウルトラミクロトームで切断し、切片を1%トルイジンブルーで染色し、切片の向きを調べます。切片作成の最適な横断面が得られるように組織ブロックを向きます。
- 厚さ70nmの超薄切片をウルトラミクロトームでカットし、Formvarカーボンコーティングされたニッケルスロットグリッドに集めます。
- 蒸留H2Oでグリッドを1回洗浄し、その後、トリス緩衝生理食塩水(TBS、0.05 M Tris緩衝液、0.7% NaCl、pH 7.6)を3回洗浄します。
- TBSで5%ウシ血清アルブミン(BSA)を20 μl滴で30分間インキュベートし、次にヤギの抗コレラ毒素サブユニットB(抗CTB、1:3,000)と1つのN-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDAR)サブユニット(抗ウサギグルタミン酸作動性NMDARサブユニットA [GluN2A] 1:50、GluN2B 1:30 α)を含む混合物を20 μl滴でインキュベートします。[AMPA]受容体、1:30)のTBS-Triton(TBST、0.01%Triton X-100、pH 7.6)で、RTで2%BSAおよび0.02 M NaN3 O / N。
- TBS(pH 7.6)を10分、10分、20分、TBS(pH 8.2)の3滴(20μl)でグリッドを5分間洗浄します。
- ロバ抗ウサギ免疫グロブリンG（IgG（IgG）1:20)を10nm金粒子に結合し、ロバ抗ヤギIgG）を18nm金粒子に結合した混合物(20μl)に2時間グリッドをインキュベートします。TBST（pH 8.2)で2%BSAと0.02 M NaN3を含んだ状態で 。
- グリッドをTBS(pH 7.6)の20μl滴で5、5、10分間洗浄し、その後超純水で乾燥させます。
- 蒸留H2O中の5%酢酸ウラニルと0.3%クエン酸鉛でグリッドを暗所でそれぞれ8分間と5分間対比染色します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| パラホルムアルデヒド | EMS | 15710 | |
| Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Σ | S9638 | |
| Na2HPO4 | Σ | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Σ | C-8106 | |
| BSA | Σ | A-7030 | |
| Triton X-100 | Σ | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | フィッシャー | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | ミリポア | AB1555P | 希釈 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | 希釈 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | 希釈1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| ロバ反ウサギ IgG-10 nm 金粒子 | EMS | 25704 | 希釈 1/20 |
| ロバ反マウス IgG-10 nm 金粒子 | EMS | 25814 | 希釈 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm 金粒子 | EMS | 25812 | 希釈 1/20 |
| ロバ反ヤギ IgG-18 nm 金粒子 | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | 希釈 1/20 |
| Formvar-Carbon コーティングされたニッケルスロットグリッド。 | EMS | FCF2010-Ni | |
| 酢酸ウラニル | EMS | 22400-1 | |
| メタノール | EMS | 67-56-1 | |
| クエン酸鉛 | カ | ||
| ライカ EM AFS | ライカ | ||
| ライカEM CPC | ライカ | ||
| ウルトロミクロトーム | ライカ | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| 液体窒素 | ロバーツ 酸素 | ||
| プロパン | ロバーツ オキシジェン | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4000 |
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