組換え細胞における匂い物質受容体活性化のリアルタイムモニタリング

要約

出典:de March, C. A. et.al., 気相中の匂気物質による匂い受容体活性化のリアルタイム In Vitro モニタリング。J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、発光測定を使用して、組換え哺乳動物細胞の匂い受容体の活性化をリアルタイムで監視する方法を示しています。匂い物質の結合は、Gタンパク質の活性化とcAMP産生を誘発し、基質結合時に発光を放出するグロセンサータンパク質を活性化し、受容体応答の定量的測定を提供します。

プロトコル

1. Hana3A Cells Culture

1. M10 (Minimum Essential Medium (MEM) plus 10 % v/v w-v-v, fevine serum (FBS)) と M10PSF (M10 と 100 μg/mL のペニシリン-ストレプトマイシンと 1.25 μg/mL のアムホテリシン B) を準備します。
2. 37°Cと5%の二酸化炭素(CO2)に設定されたインキュベーター内の100mm細胞培養皿で、10mLのM10PSFで細胞を培養します。
3. 2日ごとに細胞を20%の割合で分割します：位相差顕微鏡で細胞の100%の合流点（約1.1×10⁷細胞）が観察されたら、培地を吸引し、10mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を穏やかに洗浄してください。

結果

図1:蒸気臭気剤による臭気受容体活性化のリアルタイムモニタリングのための概略プロトコル 臭気剤(紫色)を鉱物油(A)で所望の濃度で希釈した。次に、溶液を新しい96ウェルプレートに播種し、それをルミノメーターチャンバーに5分間入れて、蒸気臭気剤で体積を平衡化してから、トランスフェクションされた96ウェルプレートをモニターしました(B)。臭気溶液を、トランスフ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% トリプシン - EDTA(1x)、フェノールレッド - 4°C
100 mm細胞培養皿	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm 円錐形のチューブ
96-well plate	Corning	3843	96 まあ、LEの蓋は白で、底は透明 Poly-D-lysineコーティングされたポリスチレン
Amphotericin	Gibco	15290-018	アムホテリシンB 250 μg/mL - 4 °C
遠心分離機	Jouan	C312	15 mL用のスイングバケットローター付き遠心分離機
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE
NU-407-500	細胞培養
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum - -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP 試薬発光タンパク質基質 - -20 °C で保存
インキュベーター 37 °C; 5 % 二酸化炭素	Fisher Scientific	11-676-604<
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 試薬 1mg/ml トランスフェクション試薬 - 4°で保存C
照度計 POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 発光
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent - 室温で保存
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle's salts & L-glutamine - 4 °C
ペニシリン/ストレプトマイシン	Sigma Aldrich	P4333	ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を10,000Uのペニシリンと10mgのストレプトマイシンで安定化 - -20°C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP発光タンパク質プラスミド - 4°C
位相差顕微鏡	Leica	090-131.001	x4、x10、x20対物レンズを備えた位相差顕微鏡
RTP1S	H. Matsun lab	-	100 ng/μL プラスミド -

で保存で保存のためのFumehoodで保存td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>細胞培養用インキュベーター用ウェルプレートリーダーで保存で保存で保存4°Cで保存