組換え細胞における匂い物質受容体活性化のリアルタイムモニタリング

要約

出典:de March, C. A. et.al., 気相中の匂気物質による匂い受容体活性化のリアルタイム In Vitro モニタリング。J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、発光測定を使用して、組換え哺乳動物細胞の匂い受容体の活性化をリアルタイムで監視する方法を示しています。匂い物質の結合は、Gタンパク質の活性化とcAMP産生を誘発し、基質結合時に発光を放出するグロセンサータンパク質を活性化し、受容体応答の定量的測定を提供します。

プロトコル

1. Hana3A Cells Culture

1. M10 (Minimum Essential Medium (MEM) plus 10 % v/v w-v-v, fevine serum (FBS)) と M10PSF (M10 と 100 μg/mL のペニシリン-ストレプトマイシンと 1.25 μg/mL のアムホテリシン B) を準備します。
2. 37°Cと5%の二酸化炭素(CO2)に設定されたインキュベーター内の100mm細胞培養皿で、10mLのM10PSFで細胞を培養します。
3. 2日ごとに細胞を20%の割合で分割します：位相差顕微鏡で細胞の100%の合流点（約1.1×10⁷細胞）が観察されたら、培地を吸引し、10mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を穏やかに洗浄してください。
4. PBSを吸引し、0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA、0.48 mM)を3mL追加します。細胞がプレートから解離するまで、約1分間作用させます。
5. 5mLのM10を追加してトリプシンを不活性化し、最終的にピペッティングで上下に動かしてプレートに付着したままの細胞を切り離します。
6. 容量(8mL)を15mLのチューブに移し、200 x gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、ピペッティングで上下に動かして細胞を5mLのM10PSFに再懸濁し、任意の細胞塊を破壊します。チューブ内に気泡を作らないようにしてください。
7. 再懸濁した細胞溶液を新しい100mmの細胞培養皿に移し、新鮮なM10PSFを9mL加えます。37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします。

2. トランスフェクションのための細胞の準備

1. 位相差顕微鏡で観察することにより、コンフルエンスまたは細胞の数を評価します。1つのプレートには、少なくとも10%のコンフルエンス(約1.1 x 10⁶細胞)が必要です。
2. 培地を吸引し、10mLのPBSで細胞を優しく洗います。PBSを吸引し、3mLのEDTAを加えます。細胞がプレートから解離するまで、室温で約1分間作用させます。
3. 5mLのM10を追加してトリプシンを不活性化し、最終的にピペッティングで上下に動かしてプレートに付着したままの細胞を切り離します。容量(8 mL)を15 mLチューブに移し、200 x gで5分間遠心分離します。
4. 上清を吸引し、ピペッティングで上下に動かして細胞を5mLのM10PSFに再懸濁し、任意の細胞塊を破壊してください。チューブ内に気泡を作らないようにしてください。
5. トランスフェクションするプレートの数に応じて、適切な量の細胞を適切な量のM10PSFのリザーバーに移してください。1枚の96ウェルプレートに、100%コンフルエントな100 mmディッシュ(約1.1 x 10⁶細胞)の1/10をM10PSFで希釈して、総容量6 mLになるようにプレーティングする必要があります。100%コンフルエンス100 mmディッシュから96ウェルプレート1枚につき、再懸濁した細胞5 mLから500 μLを新鮮なM10PSF5.5 mLに加えます。セルとM10PSFを気泡を発生させずに混合します。
6. マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートの各ウェルに50μLの懸濁細胞をピペットで入れます。37°Cおよび5%CO₂で一晩インキュベートします。

3. プラスミドトランスフェクション

1. 96ウェルプレートを位相差顕微鏡で観察し、細胞のコンフルエンスが30%から50%であることを確認します。
2. 表1のボリュームに続いて、プレート全体に共通のプラスミドを含む最初のトランスフェクションミックスを準備します（受容体輸送タンパク質1（RTP1S）、匂い受容体（OR）、およびGlosensorタンパク質の短縮版）、材料の表を参照）。Rho タグ付き OR の数量は、複数の OR の場合は OR の数で割る必要があることに注意してください。
   注：実験計画に空のベクトルネガティブコントロール（ここではRho-pCI）と任意のポジティブコントロール））テストされた匂い物質に反応することが知られている）を追加することを強くお勧めします。
3. 500 μLのMEMと20 μLのLipofectamine 2000試薬を含む2つ目のトランスフェクションミックスを準備します（96ウェルプレート1枚につき有効、材料表を参照)。2つ目のミックスを1つ目のミックスに加え、ピペッティングで上下させて穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートします。M10を5mL加え、穏やかに混ぜます。
4. 以前にメッキした96ウェルプレートのM10PSFを、最終トランスフェクション培地の50μLで置き換えてください。37°C、5%CO₂に設定されたインキュベーターでインキュベートし、ルミノメーターのチャンバーを一晩真空にします。

4. Substrate Incubation

1. 96ウェルプレートを位相差顕微鏡で観察し、細胞のコンフルエンスが60%から100%であることを確認します。10 mMのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)と5 mMのD-グルコースを含むHank's Balanced Salt Solution(HBSS)のシミュレーション溶液を準備します。
2. 75 μLの環状アデノシン一リン酸（cAMP）試薬（材料表参照）溶液を刺激溶液2.75mLに希釈してください。トランスフェクション培地を96ウェルプレートから取り出し、各ウェルに50 μLの新鮮な刺激溶液を加えて細胞を洗浄します。
3. 刺激溶液を取り出し、ステップ4.2で調製したcAMP試薬溶液25μLを各ウェルに加えます。96ウェルプレートを室温で、暗くて臭気のない環境(たとえば、化学物質や臭気源から遠く離れた清潔な空の引き出し)で2時間インキュベートします。

5. 匂い刺激

1. まず、揮発性の匂い分子で光度計のチャンバーを平衡化します。臭気物質を10mLの鉱油で目的の濃度に希釈します(図1A)。cAMP試薬のインキュベーション時間が終了する前に、25 μLの臭気溶液を新しい96ウェルプレート(細胞を含むプレートではない)に加えます。この匂いプレートを室温でルミノメーターチャンバー内で5分間インキュベートします(図1B)(ここではルミノメーターの記録は必要ありません)。
2. 20サイクルのプレート測定中に0秒の遅延で発光を記録するようにルミノメーターを設定します。サイクル間の間隔は00秒です。
3. プレートを読む直前に、チャンバーから臭気プレートを取り出してください。細胞を含む96ウェルプレートのウェル間に25μLの臭気物質を加え(細胞を含むウェルに臭気物質を添加しないでください)、30分以内にすべてのウェルの発光測定を20サイクル迅速に開始します(図1C)。

表1:トランスフェクションのためのミックス。MEMに添加するプラスミド(Glosensorタンパク質、RTP1SおよびOR)の量をMEMに追加して、1つの96ウェルプレートにトランスフェクションします。

	96ウェルプレートあたり
MEM	500 μL
pGlosensor	10 ng
RTP1S	5 ng
OR	75 ng

 

結果

図1:蒸気臭気剤による臭気受容体活性化のリアルタイムモニタリングのための概略プロトコル 臭気剤(紫色)を鉱物油(A)で所望の濃度で希釈した。次に、溶液を新しい96ウェルプレートに播種し、それをルミノメーターチャンバーに5分間入れて、蒸気臭気剤で体積を平衡化してから、トランスフェクションされた96ウェルプレートをモニターしました(B)。臭気溶液を、トランスフ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% トリプシン - EDTA(1x)、フェノールレッド - 4°C
100 mm細胞培養皿	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm 円錐形のチューブ
96-well plate	Corning	3843	96 まあ、LEの蓋は白で、底は透明 Poly-D-lysineコーティングされたポリスチレン
Amphotericin	Gibco	15290-018	アムホテリシンB 250 μg/mL - 4 °C
遠心分離機	Jouan	C312	15 mL用のスイングバケットローター付き遠心分離機
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE
NU-407-500	細胞培養
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum - -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP 試薬発光タンパク質基質 - -20 °C で保存
インキュベーター 37 °C; 5 % 二酸化炭素	Fisher Scientific	11-676-604<
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 試薬 1mg/ml トランスフェクション試薬 - 4°で保存C
照度計 POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 発光
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent - 室温で保存
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle's salts & L-glutamine - 4 °C
ペニシリン/ストレプトマイシン	Sigma Aldrich	P4333	ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を10,000Uのペニシリンと10mgのストレプトマイシンで安定化 - -20°C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP発光タンパク質プラスミド - 4°C
位相差顕微鏡	Leica	090-131.001	x4、x10、x20対物レンズを備えた位相差顕微鏡
RTP1S	H. Matsun lab	-	100 ng/μL プラスミド -

で保存で保存のためのFumehoodで保存td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>細胞培養用インキュベーター用ウェルプレートリーダーで保存で保存で保存4°Cで保存