感光性色素を用いたマウス脳内血栓形成の誘導

要約

出典:Talley Watts, L., et al. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke.J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、マウスの脳に血栓形成を誘導する技術を示しています。頭蓋窓と頭蓋骨が薄くなった麻酔マウスは、高強度の光を用いて感光性色素を活性化することにより、光血栓症を発症します。このプロセスにより活性酸素種が生成され、血管壁が損傷して血栓形成が引き起こされ、最終的には脳への血流が妨げられます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医学審査委員会によって審査されています。

1. 皮質準備のための麻酔<

1. span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>マウスを酸素と混合した誘導室にマウスを置き、麻酔を誘発します。マウスが誘導されると呼吸数が減少するのを観察します。マウスの足をつまんで、マウスが鼻円錐に移動する準備ができているかどうかを判断します。注:麻酔レベルは、生体内の準備において重要なステップであり、全体的な虚血を引き起こすレベルを誘発しないように注意する必要があります。
2. マウスが十分に麻酔されたら、動物を手術/イメージングプラットフォームに移し、マウスの鼻を鼻円錐に置き、麻酔状態を維持するために1-1.2%のイソフルオランを塗布してください。残りの手順全体で体温(37°C +/- 0.5°C)を維持するために、マウスが温度制御された加熱パッドの上に横になっていることを確認してください。麻酔下での乾燥を防ぐために、獣医の軟膏を目の上に置きます。
3. システムに付属のテールクリップまたはフットクリップを使用して、パルスオキシメトリーシステムを使用してマウスの生理機能を監視します。呼吸数が50〜65呼吸/分の間に維持されていることを確認してください。動物の長期的な生存を確保するために、心拍数が300〜450 bpmに保たれ、酸素飽和度が97〜98%に維持されていることを確認してください。
4. マウスが適切に麻酔されたら、電動バリカンを使用して頭蓋骨の上の毛を剃り、残った毛を取り除き、ベタジンできれいにし、その後エタノール綿棒で拭いてください。この手順を最大3回繰り返して、無菌の手術環境を確保します。

2. 外科的処置

1. 頭皮を完全に洗浄し、剃毛した後、マウスの頭皮に5mmの切開を行い、頭蓋裂傷を明らかにし、ブレグマを特定します。
2. 滅菌綿のアプリケーターを使用して、頭蓋骨の上に残っている筋膜を取り除きます。
Bregma: -1 to -3 mmおよびlateral: 2-4 mmの定位固定座標を使用して、組織接着剤で組織接着剤を組織接着剤でカスタムメイドのステンレス製リング（図1）を接着します。注：注：接着剤は通常、リングを骨に装着してから2分以内に固まります。
4. リングを固定装置ホルダー（図2）に取り付けて、マウスを安定させ、イメージング中の動きを防ぎます。
5. 手術用顕微鏡で、速度制御されたドレメルのようなツール（Meisinger 3.9 mmドリルビット）を使用して頭蓋骨の1〜2mmの部分をゆっくりとドリルで穴を開けます。これは、ジグザグパターンを使用して実現します。熱の蓄積を避けるために、ドリル速度を遅く設定し、頻繁に休憩を取ります。
6. 頭蓋骨が光沢のある外観になったら、同じジグザグパターンのメスの刃を使用して頭蓋骨の薄化を続け、頭蓋骨の薄い層のスムーズな除去を容易にするために、薄くなった表面を水平に保ちます。メスの刃の先端を使用して、軽い圧力で小さな直線的なストロークを行い、一度に骨の薄い層を取り除きます。血管系が解剖顕微鏡ではっきりと見えるようになるまで続けます。
7. もし実験者が間伐の過程で頭蓋骨を貫通したり壊したりした場合は、その下にある皮質に損傷を与える可能性があるため、動物を安楽死させてください。
   注：マウスの頭蓋骨の厚さは約300μmで、コンパクトな骨の2つの薄い層(外側と内側の1つの層)と、コンパクトボーンの2つの層の間に挟まれた海綿状の骨の層で構成されています。緻密骨の外層と海綿状骨の大部分は、5 mmの穿孔領域内で除去され、約50 μmの緻密骨の層が残ります(図2Bを参照)。血管系を可視化することで、最終的な無傷の薄くなった頭蓋骨の厚さが約50μmであることが保証されます。したがって、頭蓋骨は、この厚さに薄くしてもまだ存在しています。

3. 顕微鏡のセットアップ

1. 対物レンズインバータを備えた倒立顕微鏡システム（従来型、共焦点型、または二光子系)を使用してください。注：標準的な直立顕微鏡を利用することも可能です。制限要因は、ステージと目標の間のスペースです。このセットアップを実現するには、ステージの変更が必要になる場合があります。
2. 外科/イメージングプラットフォームを顕微鏡の基部の脇にあるカスタムメイドのステージに固定します。注:このプラットフォームは、対物レンズの下での外科/イメージングプラットフォームの垂直方向の動きを可能にするために、実験室用ジャッキを使用して作られています。実験室用ジャッキは、4つの円筒形のポールに取り付けられたプレートに取り付けられています。(図2を参照)。
3. 頭蓋窓上に20倍の対物レンズを含む対物レンズインバーターを配置します。外部光源を使用して、顕微鏡の接眼レンズを通して頭蓋窓を見つけ、対物レンズをイメージング領域に配置します。注:イメージング領域は、血管系の存在によって示されます。
4. 水ベースの対物レンズについては、人工脳脊髄液 (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl; 12 mM KH₂PO₄; 200 mM NaHCO₃; 30 mM ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸 [HEPES]; 100 mM グルコース) を、イメージング中に頭蓋腔に漏れる可能性があるため、培地として使用してください（図3）。

4. Rose Bengal Dyeの準備、投与、脳卒中の誘導

1. 新鮮な20 mg/mlのRose Bengal溶液をCSFで調製し、投与前にろ過して滅菌してください。ローズベンガルを混ぜた後は、再利用したり保管したりしないでください。実験ごとに新しい解決策を作成します。
2. 561 nmのレーザーで頭蓋窓をスキャンしながら、Rose Bengalの0.1mlの尾静脈注射を行い、溶液の適切な注入を確認します。注: ローズ ベンガルは、脳の血管系に注射されてから 5 秒以内に視覚化されます。容器全体をローズベンガルで満たす必要があります。
3. Rose Bengal染料を適切に注入した後、特定の病変体積の再現性を確保するために、血管の直径(40-80 μm)に基づいて血栓症に適した血管を選択してください。血流の方向を見て動脈と静脈を区別します:動脈は大径の血管から小径の血管に移動し、静脈は小径の血管から大径の血管に移動します。これは、Rose Bengal が注入されると、視覚化によって簡単に実現できます。
4. 顕微鏡の設定を次のように変更してください
   1. ：滞在時間を増やしてください。注:これは、使用する顕微鏡システムによって異なります。
   2. レーザー出力を100%に増やしてください。
   3. 最大スキャン速度を使用して、1フレーム/秒で時系列画像を収集します。
5. 容器内に安定した血栓が形成されるまでマウスをスキャンします。注:これは通常、連続スキャンから5分以内に達成されます(図4を参照)。
6. Rose Bengalを使用して血栓形成を誘導した後、マウスをイメージングエリアから取り外して解剖顕微鏡に戻してください。頭蓋骨からステンレス鋼のリングを慎重に取り外します。頭蓋窓に出血がないか調べます。出血が発生した場合は、実験を終了します。
7. 6.0モノフィラメント縫合糸を使用して、頭蓋骨の上の切開を閉じます。感染を防ぐために、縫合線に沿って抗生物質軟膏を置きます。痛みの管理のために、ブプレネックス(0.05 mg / kg)を12時間ごとに3日間皮下注射します。.
8. 麻酔薬からマウスを取り外した後、完全に覚醒して自由に動くまで回復室に戻します。
9. マウスをきれいなケージに戻して、後でさらに調査してください。

結果

Figure 1: Stainless Steel Ring. 3つの図(上面図、側面図、下面図)が示されており、マウスの頭蓋骨に装着して定位固定装置に固定するステンレス製のリングホルダーを示しています。

図2:RB光血栓症のための顕微鏡イメージングプラットフォームのセットアップ

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
ローズベンガル	シグマ	330000
イソフルラン麻酔薬	MWI獣医用品	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM グルコースと 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
Equipment
解剖ハサミ	バイオインダストリアル製品	500-410
操作ハサミ 14cm	バイオインダストリアル製品	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, ストレート	バイオインダストリアルプロダクツ	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent 麻酔machine	DRE株式会社	15001
Tech IV イソフルラン気化器	DRE, Inc.	34001
F エアキャニスター	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 酸素タンク用レギュレータ	DRE, Inc	.CE001E
げっ歯類誘導室	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill デュアル電圧110/120	フォアダム	134.53