背根神経節注射と背根挫傷傷を用いたラットの感覚軸索再生のモデル化

要約

出典:Cheah, M., et al.感覚軸索再生のモデルとして、背根神経節注射と背根潰傷傷。J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、麻酔をかけたラットの後根神経節(DRG)にウイルス懸濁液を注入し、後根挫傷を介して制御された軸索損傷を誘発する手順を段階的に示しています。このプロトコルには、DRGを露出させ、軸索再生を促進するための成長促進ウイルスベクターを送達し、脊髄への軸索接続を切断して感覚神経損傷と再生をモデル化することが含まれます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. DRGの注入と背根挫傷害の実施

注:これは非常にデリケートな手術です。生きた動物の手術に進む前に、まずいくつかの死んだ動物で練習して解剖学に慣れることをお勧めします。

1. 皮膚の上の顕著なC2およびT2棘突起を見つけます。No.10メスの刃でC2とT2の棘突起の間に皮膚を切開します(皮膚が開くと、筋肉の最初の層に白い繊維組織の正中線が見えるはずです。
2. メスの刃を使用して、白い正中線に沿った筋肉の最初の層に同様のサイズの切開を行います。その近くに下行大動脈からの主要な動脈枝があるため、顕著なT2棘突起を超えないでください。
   注: このステップ以降のどこでも大量の出血が発生する可能性があります。常に出血を止め、滅菌した綿棒または外科用吸収性スポンジを使用して血液を取り出し、常に鮮明に視覚化できるようにします。「盲目的に」手順を進めると、脊髄、DRG、または背根に望ましくない損傷が生じ、後で動物に予期しない悪影響を及ぼす可能性があります。
3. 吻側と尾側に配置された2つのリトラクターを使用して、筋肉の最初の層を引っ込めます。縞模様の外観を持つ筋肉の2番目の層が見えるはずです。
4. 筋肉の2番目の層の正中線を見つけます(2つの縦方向の筋肉が薄い膜組織で接続されているのを観察できます)。一対のマイクロハサミを使用して膜組織を解剖し、2つの縦筋を分離します。メスの刃の使用は、不必要な筋肉の損傷や出血を引き起こす可能性があるため、可能な限り避けてください。
5. それに応じてリトラクターを調整して、脊椎を覆う細い筋肉の3番目の層を露出させます。棘突起は、筋肉の第3層に一対の鉗子で軽く触れることで感じることができます。
6. マイクロハサミで筋肉の3層目に小さな切開を行い、キュレットやメスで骨から筋肉を横向きにそっと削り取ると、椎骨がはっきりと露出します。必要に応じて、椎弓切除を容易にするために、筋肉や腱の一部を切り取ります。
7. 左のC5-C8 DRGを露出させるには、C4-T1椎骨の左半椎弓切除術を行い、一対の細いロンジャーを使用して椎弓板と椎弓根の一部を慎重に除去します。DRGは、椎骨の横孔の近くに位置しています。
   注: C3 - C7 椎骨には顕著な棘突起はありません。C5 DRG は C4 椎骨と C5 椎骨の間、C6 DRG は C5 椎骨と C6 椎骨の間、C8 DRG は C7 椎骨と T1 椎骨の間にあります。C8 DRGとC8脊髄セグメントが存在するにもかかわらず、C8椎骨はありません。
8. 十分な量のDRGが注射用に露出したら、カスタムメイドの33ゲージの鈍い針を取り付けたウイルス充填マイクロリットルシリンジを定位固定装置シリンジホルダーに置いてシリンジを準備します。注射する前に、30ゲージの斜めの針を使用して、注射針の挿入を支援するために、対象となるDRGのそれぞれに小さな表面的な開口部を作ります。
9. ノブを軽く回して33ゲージの針をDRGの中央に挿入し、脳定位座標を調整します。DRGの腹側から液体が漏れる可能性があるため、針を過度に挿入しないでください。漏れが発生した場合は、すぐに針の位置を調整してください。
   注: 数値定位固定座標は使用されません。ただし、フレームを利用して注射用の針を保持すると便利です。
10. 輸液シリンジポンプを使用して、1 μL のウイルスを 0.2 μL/分で各 DRG に注入します。針を引き出す前に、さらに3分待ちます。注入中、ウイルス溶液に着色染料が含まれている場合、DRGはゆっくりと色が変わります。
11. 同時C5-C8後根潰傷害を実行するには、鉗子の端を完全に対向させる、先端の細い鉗子(Bonn Micro)のペアを使用して、各根をそれぞれ10秒間3回潰します。組織の白い線が押しつぶされた場所に現れるはずです。鉗子で必要以上に深く入ると、腹側根に損傷を与える可能性があるため、深く入らないでください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Fast Green FCF dye	Sigma-Aldrich	F7258	無色の溶液を視覚化するため。推奨濃度: 1%
Olsen-Hegar Needle Holder	Fine Science Tools	FST 12502-12
フリードマン・ピアソン・ロンガー湾曲0.7mmカップ	Fine Science Tools	FST 16121-14
ボンマイクロ鉗子	Fine Science Tools	FST 11083-07	後根挫傷
組織分離ハサミ	Fine Science Tools	FST 14072-10
Fine Scissors	Fine Science Tools	FST 14058-11
Micro-Adson Forceps	Fine Science Tools	FST 11018-12
Goldstein Retractor	Fine Science Tools	FST 17003-03
Vannas Spring Scissors (straight)	Fine Science Tools	FST 15018-10
SURGIFOAM吸収性ゼラチンスポンジ	Ethicon	1972	出血制御
マイクロリットル注射器 RN701 (10μl)	Hamilton	80330
カスタムメイドの取り外し可能な針（DRG注射用)	Hamilton	7803-05	33ゲージ、38mm、ポイントスタイル 3
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller	World Precision Instruments	UMP3-1<

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