レーザー誘発脳損傷ラットモデルにおける血液脳関門完全性の評価

要約

出典:Kuts, R. et al.Laser-induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、ラットのレーザー誘発脳損傷後の血液脳関門(BBB)の完全性の評価を示しています。尾静脈にトラッキング色素が注入され、脳に循環し、損傷したBBBを介して組織に漏れます。その後、脳が抽出され、処理されて色素が放出されます。色素の蛍光強度を測定して、レーザー誘起BBB損傷の程度を定量化します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医学審査委員会によって審査されています。

1. レーザー誘発脳損傷実験手順

1. 20匹のラットを別の対照群に割り当てます（偽操作)。
2. レーザーグループラットを50J X 10ポイントのレーザー照射に次の方法でさらします：<ol style='list-style-type:decimal;'
3. 酸素中の2%イソフルランの混合物でラットに麻酔をかけ、自発的な換気を可能にします。鉗子で尾をつまんで、離脱反射がないことを確認して、十分な麻酔の深さを確認します。
4. 直腸温度調節された加熱パッドを使用して、実験手順全体を通してラットの深部体温を37°Cに維持してください。
5. 地元の髪の毛をシェーバーで取り除き、70%のアルコールと0.5%のグルコン酸クロルヘキシジンで消毒してください。消毒手順をさらに2回繰り返します。
   注:外科的切開のサイズは約3cmである必要があります。切開領域の周囲に少なくとも2cmの髪を取り除きます。
6. ラットを定位固定装置のヘッドホルダーに腹臥位で置き、頭皮を横方向に反射させ、ブレグマとラムダの間の領域を露出させるために3cmの切開を行います。
7. 鼻円錐を通して麻酔を維持します。
8. ネオジムドープイットリウムアルミニウムガーネット（Nd-YAG）レーザー（ピーク波長1064nm）を使用して、右半球の上の頭蓋骨の露出領域に50J X 10点を1秒のパルス持続時間で照射します。
9. 装置のレーザー発生部分が露出領域から2mm離れていることを確認して、レーザービームを生成します。50J X 10ポイントは、異なるエネルギー/表面の組み合わせを慎重に評価した後に選択されました。この組み合わせは効率的であり、投与後に頭蓋骨の骨破壊を1秒未満引き起こしません。
   注：2mmはレーザービームの端子(通過する光ケーブルから)と頭蓋骨との間の距離です。集光レンズを使用する場合は、レンズの傾斜角を考慮して距離を計算し、ビームを目的の損傷領域に集束させる必要があります。レーザーデバイスを使用するときは、適切なトレーニングや目の保護など、適切な安全性を確保してください。
10. ラットをデバイスから取り外し、3-0シルクの外科用縫合糸で頭皮を閉じます。
11. 麻酔を中止し、ラットをケージに戻して回復させます。0.1 mL の 0.25% ブピバカインを局所投与して、手術直後の術後の痛みを軽減します。
    注：正しく実行すれば、全体の手順は5分以内で完了するはずです。

麻酔後の回復中にラットに苦痛の兆候がないか観察してください。麻酔から復帰する前に、術後鎮痛のために0.01mg / kgの筋肉内ブプレノルフィンを投与し、少なくとも48時間、12時間ごとに繰り返し投与を続けます。.

被験者はラットをレーザーにさらすことなく、同じ条件で制御します。

2. 神経学的重症度スコア（NSS)

1. レーザー誘発性脳損傷の24時間後に43点のスコアを使用して神経学的重症度スコアを評価します。神経学的欠損、行動障害、ビームバランス課題、反射神経について動物をテストし、より重度の障害に対してより高いスコアを割り当てます。

3. 脳損傷

1. の評価血液脳関門(BBB)の破損の程度の決定
   注:次のようにレーザー誘発脳損傷の24時間後にBBBの破損を評価してください：<ol style='list-style-type:decimal;'>
2. 4mL/kgの生理食塩水と混合した2%のエバンスブルーをカニューレされた尾静脈を介してラットに静脈内投与し、溶液を1時間循環させます。
3. 最後のNSSの24時間後に、ラットを20%の酸素と80%の_CO2（吸気による)に曝露して安楽死させます。
4. 次のように血管内局在染料を採取します：<
   1. span style='background-color:transparent;color:#000000;'>手術用のピンセットと手術用のハサミでラットの胸部を開いてください。
   2. 右心房から無色の灌流液が得られるまで、左心室から冷やした0.9%生理食塩水で動物を灌流します。
5. 脳を収穫し、それらを吻側に2mmのスライスにスライスします。
6. 左脳スライスを右部分から分離して、負傷した半球と負傷していない半球を別々に評価します。
7. 計量し、乳鉢と乳棒を使用して均質化し、脳組織を50%トリクロロ酢酸で24時間インキュベー
トします。
8. 均質化された脳スライスを10,000 × gで20分間遠心分離します。
9. 遠心分離した脳からの上清1mLと96%エタノール1.5mLを1:3で混合し、620nmの励起波長(10nm帯域幅)と680nmの発光波長(10nm帯域幅)の蛍光検出器を使用して血液脳関門の破損を評価します。
   注:ラットの両方のグループは、BBBの内訳を決定するための同じプロトコルを受けます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
50% トリクロロ酢酸	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Brain & Tissue Matrices	SIGMA - ALDRICH	15013
カニューレ Venflon 22 G	KD-FIX	1.84E+11
Centrifuge Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	SIGMA 2-16P
Compact Analytical Balances	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
解剖ハサミ	SIGMA - ALDRICH	Z265969
エッペンドルフピペット	SIGMA - ALDRICH	Z683884
エッペンドルフチューブ	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
エタノール 96 %	ROMICAL		可燃性液体
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf	Switzerland model Infinite 200 PRO マルチモードリーダー
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
オリンパス BX 40 顕微鏡	リンパス
ペトリ皿	SIGMA - ALDRICH	P5606
メスブレード 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (ネオジムドープイットリウムアルミニウムガーネット) レーザー加工機	Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder	KOPF	900LS
滅菌シリンジ 2 ml	ブラウン	4606027V
シリンジ針 27 G	ブラウン	305620

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