内皮細胞におけるタイトジャンクションタンパク質およびストレスファイバーの蛍光局在

要約

出典:Alluri, H., et al.Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオは、ラット脳微小血管内皮細胞(RBMEC)におけるタイトジャンクションタンパク質とストレスファイバーの蛍光局在を示しています。ストレスを受けた単分子膜では、蛍光標識された抗体を使用してタイトジャンクションタンパク質をタグ付けし、蛍光色素でタグ付けされたファロイジンがストレスファイバーを標識します。次に、標識された分子を共焦点顕微鏡で可視化します。

プロトコル

1. 内皮細胞の播種

1. 成体のSprague DawleyラットからRBMECの初代培養物を入手します(または市販で入手します)。
2. ラット脳内皮細胞増殖培地を用いて、100 cmフィブロネクチン(50 μg/ml)コーティングシャーレでRBMECを培養します。コンフルエントに達するまで、2日ごとに培地を交換してください。
3. 80〜90%のコンフルエントに達したら、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を渦巻きながら穏やかに洗浄します。次に、細胞を1 mLの温かい0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液にさらし、37°Cに平衡化して細胞を分離します。
4. 細胞が剥離して分散するまで、細胞を37°Cで2〜5分間インキュベートします。
   NOTE: 培養皿をタップすると、細胞が切り離されます。顕微鏡で細胞を観察し、皿の表面から細胞が完全に剥離していることを確認します。
5. トリプシンを中和するために、ペトリ皿に5 mlの完全な培地を追加します。分離した細胞を含む培地をピペットで取り出し、15 mLの遠心チューブに集めます。
6. 内皮細胞を含む培地を220 x gで5分間遠心分離します。
7. 上清を吸引し、ペレットを含む細胞を保存します。ペレットをピペットで上下に穏やかに混合することにより、3〜5 mlの新鮮なラット脳内皮細胞増殖培地に懸濁します。その後、細胞は自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用してカウントされます。
8. 細胞懸濁液をフィブロネクチン(50μg/ml)にプレコートされた8ウェル無菌チャンバースライドシステムに移します。0.7 cm²/ウェルで、播種密度はウェルあたり10,000〜15,000細胞です。コンフルエンスが得られるまで37°Cでセルを成長させます
   NOTE:ウェスタンブロットなどの実験のために、10cmの細胞培養皿や実験に必要な専用皿で細胞を増殖させることができます。

2. 酸素とグルコースの欠乏-再酸素化 (OGD-R) In Vitro モデル

1. 低酸素細胞培養システムを使用して、OGD-RがRBMECに及ぼす影響を研究します（<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'図1).実験を開始する前に、製造元の指示に従って、低酸素細胞培養システムをセットアップし、キャリブレーションします。
2. コンフルエントチャンバースライド(ステップ1.8)を37°Cインキュベーターから取り外します。チャンバースライド内の完全な培地を脱酸素化されたグルコースなしのダルベッコ修正イーグルス培地(DMEM)に交換し、95%の低酸素チャンバーに入れます。N₂ and 5% CO₂ 37°Cで2時間、OGD状態を表します。
3. 細胞をインキュベーターに戻します。O₂, 5% CO₂し、新鮮なラット脳内皮細胞完全培地を提供し、37°Cでさらに1時間インキュベートします。
   NOTE: このステップ再酸素化の状況を表します。
4. チャンバースライドは、免疫蛍光の局在化およびローダミンファロイジンの標識に使用します(セクション3を参照)。

3. zonula occludens-1 (ZO-1) と糸状アクチンの免疫蛍光局在 (f-actin) ローダミンファロイジンを使用したラベリング

1. RBMEC単層を含むチャンバースライドを100 μlのopti-MEM/還元血清培地/ウェルに1時間さらします。チャンバースライドを100 μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.0-7.2)で3回洗浄してください。
2. 4%パラホルムアルデヒド100μlのPBS(pH 7.0-7.2)で15分間細胞を固定し、チャンバースライドをPBS(pH 7.0-7.2)でさらに3回洗浄します。
3. 0.5% Triton X-100 in PBS(pH 7.0-7.2)100 μLでさらに15分間、細胞を透過処理します。2%ウシ血清アルブミン(BSA)100μlをPBS溶液中で1時間ブロックします。このステップの後、ZO-1またはf-actin.
   1. 免疫蛍光染色のために、ZO-1に対する抗ウサギ一次抗体を1:150で細胞をインキュベートし、2% BSA-PBSで4°Cで一晩(O/N)調製してください。PBS(pH 7.0-7.2)で細胞を3回洗浄してください。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)タグ付き抗ウサギ二次抗体100 μlと室温(RT)で1時間インキュベー
   トします。
   2. ローダミンファロイジンの標識では、ブロッキング後、細胞を1:50希釈のローダミンファロイジン100μlに20分間さらします。これは2%BSA-PBSで調製されます。
   3. PBS(pH 7.0-7.2)の免疫蛍光染色およびローダミンファロイジン標識から細胞を洗浄します。4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む退色防止試薬を含む封入剤を使用してチャンバーをマウントします。
4. 60 倍の水浸レンズを使用して細胞を視覚化し、共焦点顕微鏡で単一の光学面で細胞をスキャンします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM、グルコースなし	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 ウサギポリクローナル抗体	ライフテクノロジーズ	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 ウェル滅菌スライドガラス	サーモサイエンティフィック	177402
FITCタグ付き抗ウサギ二次抗体	サンタクルーズ	sc-2090
DPBS 1X	サーモサイエンティフィック	SH 30028.03	他のPBSは使用できます