このビデオでは、マウス脊髄損傷モデルにおける神経幹細胞(NSC)の活性化と移動を示しています。脊髄を露出させるために、脊椎の胸部領域から椎骨を麻酔マウスから取り出します。次に、曲がった針を使用して脊髄の白質に表在性の損傷が作成され、中央管が保存されます。損傷後、管を囲む神経幹細胞が活性化され、組織の修復を助けるために損傷部位に移動します。
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方法論記事
神経幹細胞の活性化と移動を研究するための最小限の脊髄損傷モデル
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2025年4月28日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 最小限の脊髄損傷手術
注: 手術前に、すべての手術器具と材料が適切な方法で滅菌されていることを確認してください(図1A)。
- 4〜5マスのガーゼを巻き上げ、中央でテープで固定してガーゼの固定ロールを取得することにより、胸部支持アーチを構築します。
- マウスを誘導チャンバーに入れ、5%イソフルランで麻酔を開始します。進行する前に、および手順全体を通して、つま先のつま先つまみ反射がないことを確認してください。手術が完了するまでに30分以上かかる場合があるため、イソフルランへの曝露を最小限に抑えるように最適化してください(5%で5分、残りの時間を2〜3%)。.
- マウスを麻酔器に取り付けられたノーズコーンに2〜3%のイソフルラン維持用量で移します。バリカンを使用して、背中の中央から首/耳まで動物の背部から毛皮を取り除き、手術のために皮膚の広い長方形の領域を露出させます。
- マウスを固定装置に移すには、付属のノーズコーンにマウスの鼻を入れ、イヤーバーで頭蓋骨を安定させます。イヤーバーの配置中はイソフルランを5%に維持し、マウスが定位固定装置に固定されたら2〜3%に戻します。.
- 術前鎮痛薬を腹腔内に投与します—メロキシカム(2.0 mg / kg)。麻酔下での角膜の乾燥を防ぐために、開いたマウスの目に目の潤滑剤をたっぷりと塗ります。
- 胸部支持アーチをマウスの腹部の下に置き、尾の付け根を軽く引っ張ってマウスの体と背骨をまっすぐにします。実験室のラベリングテープを使用して、尾とすべての伸ばした手足を星のような位置に固定します。固定したら、胸椎を支えるために、マウスの腹部から胸部上部に向かって胸部支持アーチを吻側に押します(図1B)。
- ステップ1.3で調製した毛皮で刈り取られた皮膚領域を70%エタノールで消毒し、続いてポビドンヨードで滅菌した手術野を準備します。2回繰り返します。滅菌外科用ドレープを適用して、広い滅菌フィールドを維持します。
- #10メスの刃を使用して、両方の肩甲骨の中点から胸椎の湾曲まで、動物の縦軸に平行な垂直切開を行います。皮膚を引っ込めて、軟部組織と脊柱の輪郭を露出させます(図1C)。
- 肩甲骨上脂肪パッドの下側の境界を特定します(これにより、T4/5椎骨レベルが境界になります)。同じ#10ブレードで、慎重に、しかし力を入れて、椎骨T5–T8 / 9の両側に沿って切断し、柱から背筋腱を切り離します。
- リトラクターの歯を脊椎の両側の切開部位に挿入します。リトラクターを広げて露出を調整し、収縮した筋肉層に過度の負担をかけずに脊椎を十分に持ち上げます(図1D)。
- 手術用顕微鏡で、脊椎を覆う残存筋やその他の軟部組織を慎重に洗浄し、椎骨を露出させます(図1E)。椎骨の棘突起を歯付き鉗子で握り、わずかに上下に動かすことにより、除去する椎骨を特定します。
注:これにより、椎間関節の識別が可能になり、目的の椎骨の下にある小さな開口部(椎間孔)が露出するはずです。 - 湾曲した鈍いハサミの片方の頭を露出した椎間孔の両側に挿入し、切除する椎弓板に尾を合わせ、接続している椎間関節を両側に切断します。
- 椎弓板を上に持ち上げ、椎弓板の上部のアタッチメントを切り取り、骨を分離して取り除きます。
注:これにより、脊髄を含む無傷の硬膜嚢が露出します(図1F)。過度の出血がある可能性がありますが、これは、事前にカットされた1 cm x 1 cmのガーゼを患部に置くか、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗うことで制御できます。 - 背側正中線静脈を目印にして、30 Gの針先(針斜角が上を向いている)の45°曲げシャフトを、正中線の両側に約0.5 mm横に脊髄の背外側表面(深さ約1 mm)に挿入します。
- 針を尾側から吻側(正中線に平行)に~2 mm動かして、針の斜角の全長がコードに挿入されるようにします。入口のパスをたどって針を取り除きます (図 1G )。
注:出血はないはずですが、この段階で脊椎組織の腫れが見られる場合があります。 - 傷口を閉じるには、リトラクターを取り外し、6-0吸収性縫合糸を使用して、損傷の両側の背中の筋肉を正中線で一緒に縫合します。4-0滅菌シルク縫合糸を使用して、その後、上にある皮膚を閉じます。
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結果
図1:外科手術 (A) 必要なすべてのレイアウトで、参照用に番号が付けられています。(B)体、背骨、手足をまっすぐにしてテープで留め、その下に配置された胸部支持アーチを備えた定位固定装置内のマウスの写真。(C)皮膚を縦に切開し、筋肉層と脊柱の輪郭を露出させたマウスの写真。(D)筋肉切開後のマウスの体の写真、リトラクターによる脊椎の露出と分離。引き裂かれていない張りのある筋肉層に注意してください。(E)筋肉層が除去された孤立したマウスの脊椎の写真で、椎骨の骨表面を示しています(3つのセグメント)。これはまた、棘突起と、おそらく中椎骨の椎間関節と椎弓板が除去されることも示しています。(F)椎弓切除後の...
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アグリコラリトラクター | ファインサイエンスツール | 17005-04 | |
| モリア・ヴァンナス・ウルフスプリングシザース(湾曲) | ファインサイエンスツール | 15370-50 | 注文時にカスタマイズして鈍い先端を手に入れることができます |
| グレーフ鉗子(ストレート、 1x2 Teeth) | ファインサイエンスツール | 11053-10 | |
| エクストラファイングレーフ鉗子(湾曲、鋸歯状) | ファインサイエンスツール | 11152-10 | またはその他の縫合用鉗子 |
| ハートマン止血剤(ストレート) | ファインサイエンスツール | 13002-10 | または縫合に適したその他のもの |
| メスの柄 #3 | ファインサイエンスツール | 10003-12 | またはその他適切なもの |
| バリカン | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | またはその他の適切な |
| 固定装置 | ストーリング | 51500 | またはその他の適切な |
| メロキシカム | または動物保護施設によって適切な認可を受けたもの | ||
| Tears Naturale P.M. | アルコン | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | またはその他の適切な |
| イソフルラン | バクスターインターナショナルインク | DIN 02225875 | またはその他の麻酔に適したもの |
| Q-tips Cottom綿棒 | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| 綿ガーゼ | フィッシャーサイエンティフィック | 13-761-52 | |
| 30G 針 | ベクトン・ディキンソン | 305106 | 怪我用 |
| 25G 針 | ベクトン・ディキンソン | 305122 | 薬物注射用 |
| 1mL 注射器 | ベクトン・ディキンソン | 3090659 | 薬物用注射用 |
| 3mL シリンジ | ベクトン・ディキンソン | 309657 | 液注射用 |
| 4-0縫合糸 | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | 皮膚縫合用 |
| 6-0 縫合糸 | uoftmedstore.com | VS889 | 筋肉縫合用 |
| 標準解剖ツール | ファインサイエンスツール | ||
| 解剖顕微鏡 | ツァイス | ステミ 2000 |
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