非ヒト霊長類脳組織に対する免疫組織化学の実施

要約

出典:Eid, L. & Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、電子顕微鏡用のプレエンベッド免疫組織化学を用いて、アルデヒド固定非ヒト霊長類脳組織の調製を実演しています。特定の神経細胞タンパク質を免疫標識し、続いてペルオキシダーゼ反応を起こして着色沈殿物を生成する手順を概説し、電子顕微鏡で標的タンパク質を可視化することを可能にします。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.Pre-embedding Immunohistochemistry (Figure 1C)

1. トリス緩衝生理食塩水(TBS、50 mM、pH 7.6)の4 Lストック溶液を以下のように調製します。
   1. 2Lの蒸留水を4Lビーカーで測定し、24.23gのトリヒドロキシメチルアミノメタン(THAM;C₄H₁₁NO₃)をかき混ぜて溶かします。
   2. 約148mLの1N HClでpHを7.6に調整します。酸は、pHが7.6未満に達しないように注意して追加する必要があります。総容量は4Lである必要があります
      注意: HClは非常に腐食性があります。適切なPPEを着用してください。
2. EM免疫組織化学のために処理する目的領域を含む切片を選択します。
3. 浮遊性切片をPBS(0.1 M、pH 7.4)でRTで5分間3回洗浄し、不凍液をすすぎます。
4. PBSで希釈したNaBH₄の0.5%溶液を調製します。
   1. 0.05gのNaBH₄を秤量し、PBS10mLで希釈します。カバーしないでください。使用直前にこの溶液を準備してください。
5. 新たに調製したNaBH₄溶液中の切片をRTで30分間インキュベートします。カバーしないでください。
6. PBSでRTで10分間3回洗浄し、反応ガスがなくなるまで激しく揺さぶります。
7. 2%の適切な正常血清とPBSで希釈した0.5%の冷たい魚ゼラチンを使用して、EMのブロッキング溶液を調製します。
   注: 次の3つのステップで十分な量を確保するために、数量を計算する必要があります。二次抗体を宿主とする同じ動物種から作られた血清を使用してください。抗原賦活化法の使用や少量のトリトンの追加(抗体の浸透性を高めるため)は避けてください。これらの方法は組織の品質を著しく損なうからです。
8. ブロッキング溶液中の切片をRTで1時間インキュベートします。
9. ブロッキング溶液で希釈した一次抗体溶液を調製します。
   注:一次抗体の濃度は通常、LM免疫組織化学の濃度と同じですが、一部の一次抗体がアクロレインと機能しない可能性があるため、事前に異なる抗体濃度で試験を実施することを検討してください。その場合、グルタルアルデヒド(0.1〜2%)と4%PFAの混合物を経心臓灌流に使用することができ、同様の結果を得ることができます。インキュベーション時間と温度も最適化します。
10. 一次抗体溶液中の切片をRTで一晩インキュベートし、穏やかに揺さぶります。以前にテストしたインキュベーション時間と温度を使用してください。
11. 切片をPBSで3回、RTで5分間、穏やかに揺らしながら洗浄します。
12. ブロッキング溶液で希釈したビオチン化二次抗体の1:1,000溶液を調製します。
    注:二次抗体は、一次抗体の生成に使用した宿主種に対して産生する必要があります。
13. 切片を二次抗体溶液中で1.5時間、RT.Rockで穏やかにインキュベートします。
14. 二次抗体インキュベーションが終了する少なくとも60分前に、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ(ABC)溶液を調製してください。
    1. 校正済みのピペットを使用して、8.80 μL/mLの溶液AおよびBを測定し、PBSで希釈します。
    2. 室温で少なくとも60分間穏やかに揺さぶり、アビジン分子とビオチン分子が完全に結合します。
15. 二次抗体溶液でのインキュベーション後、PBSで3回RTで10分間洗浄します。
16. ABC溶液中の切片をRTで1時間インキュベートします。
17. PBSで1回、TBSで2回、RTで10分間、穏やかに揺らしながら洗います。
18. 0.05% 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)を0.005% H₂O₂でTBSで希釈した新鮮な溶液を調製します。
    1. 1 DAB12.5 mgを秤量し、25 mLの冷たいTBSで希釈します。
       注意:DAB粉末は揮発性が高く、吸入すると有害です。発がん性があり、催奇形性があります。したがって、妊娠中または授乳中の女性は、希釈された場合でも、この製品を操作しないでください。操作するときはN95マスクを使用し、PPEを着用してください。
    2. 溶液を濾過し、使用直前に30% H₂O₂を4.5μL加えます。
19. DAB溶液中の切片をRTで3〜7分間インキュベートします。
    注:背景の汚れが高レベルになるのを避けるために、茶色の沈殿物は暗すぎてはいけません。それに応じてインキュベーション時間を最適化する必要があります。
20. 冷たくTBSで素早く2回洗浄し、次にRTで冷たくTBSで10分間洗浄し、続いてPBで10分間洗浄し、軽度の揺さぶりで反応を停止します。
    注:NaClの痕跡を排除するためには、PB(PBSではない)の使用が重要です。これは、NaClがオスミウムと反応して結晶を形成するためです。

結果

Figure 1: Schematics of Essential Steps of the Protocol サルの脳 (A) は、冷却ビブラトーム (B) で連続したセクションに切断されます。その後、免疫組織化学および電子顕微鏡法をプレインドームするために処理され、その後、目的領域を樹脂ブロック(C<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
二塩基性無水リン酸ナトリウム	Fisher scientific	S374-500
	SX0710-1
塩化ナトリウム (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
ヒドロキシメチルアミノメタン (THAM)	Fisher scientific	T370-500<
HCl	EMD	HX0603-3	1N 希釈。製品は腐食性です。適切なポーションと一緒に使用してください。.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N 希釈。製品は腐食性です。適切な保護具を装着して使用してください。
パラホルムアルデヒド	Sigma	P6148	4% 希釈。製品は粉末状で揮発性が高く、毒性が強いです。適切な保護を備えた通気フードの下で注意して使用してください。
Acrolein (90%)	sigma	110221	3% 希釈。製品は非常に有毒です。適切な保護を備えた通気フードの下で使用してください。
剖検ベントテーブル	Mopec	CE400<
電子灌流ポンプ	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	てるも	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	てるも	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
scalpel
メスの刃	Feather lance	201011 J9913	No.22 は手術用、No.11 は EM
手術用ハサミ
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	デバイスが許可した場合、各使用前にブレードを調整し
Vibratome razor blade	ジレット	GIN 642107	<
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% 希釈
エチレングリコール	Fisher scientific	E178-4	30% dilution
水素化ホウ素ナトリウム	sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% dilution
冷魚ゼラチン	Aurion	900.033	0.5%の希釈。元の製品は40%に集中しています
一次抗体, SERT	Santa Cruz バイオテクノロジー	SC-1458	1/500 dilution
一次抗体, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
一次抗体, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
ビオチン化二次抗体、ヤギ	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 希釈
ビオチン化二次抗体, mouse	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100<
3'3 diaminobenzidine (DAB)	Sigma	D5637	0,05% dilution.製品は粉末状で揮発性が高く、有毒です。流しにゴミを捨てないでください。
過酸化物 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% dilution

style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>EM Sciencetd style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> てください。tr style='height:19px;'>td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>8.8 μL/mL of A and B each