ミクログリアおよびニューロンのためのラット冠状組織凍結切片の免疫組織化学的染色

要約

出典:Evilsizor, M. N., et al., Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons.J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、凍結切片を作成したラット脳組織に対する免疫組織化学染色手順を段階的に示し、ミクログリアとニューロンの空間的配置を可視化します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. Tissue Staining
   1. 光のない染色ボックスに、脱イオン水に浸した糸くずの出ないティッシュで「湿度チャンバー」を作ります。
   2. スライドの端を糸くずの出ないティッシュで乾かし、ミニパップペンを使用してスライドの端に液体をはじく境界線を作り、ティッシュ部分から離れてください。この境界は、表面張力が染色に影響を与えないように、液体の半月板と組織の端との間に十分なスペースを確保する必要があります。
      注：1.1.3より前に、対象の抗体がマイクロ波抗原検索を必要としない場合、パップペン忌避境界線を適用することができます。PBSで洗う前にパップペンを貼った場合は、このステップで撥液ボーダーの完全性を確認する必要があります。ミニパップペンを使用して、境界線の隙間を埋めます。
   3. スライドを水平に置いた状態で、PBS(ブロック溶液)中の4% v/v血清でインキュベートすることにより、非特異的抗原の結合をブロックします。スライド1枚につき300μlのブロック溶液を室温で1時間ピペットで保存してください。ブロック溶液がスライドの端にあるパップペンまで伸び、組織を完全に覆っていることを確認して、組織の近くの表面張力による不均一な染色を防ぎます。
      1. 二次抗体が作られたのと同じ種の血清を使用してください。注:この手順では、二次抗体をロバで作製するため、ロバ血清を使用します。2種以上の異なる種由来の二次抗体を使用する場合は、各種由来の血清を含めてください。
   4. スライドに一次抗体をピペットで貼り付けます。注:この染色の抗体濃度は、Iba1および汎ニューロンでそれぞれ1:5,000および1:500に最適化されています。これらの濃度は、バックグラウンド染色なしで意味のある染色を示すことがわかっています。
      1. ブロック溶液をPBS中の1%血清に希釈し、一次抗体を添加してください。スライド1枚につき1%血清中の一次抗体溶液300 μlをピペットで保存してください。繰り返しになりますが、液体がパップペンの端にあることを確認します。4°Cで一晩インキュベートします。
      2. 3つのコントロールスライドを含めてください：Iba1も汎ニューロン抗体も含まないもの、汎ニューロン抗体を含まないIba1を含むもの、Iba1を含まないものも含めてください。これらのスライドを同じ溶液で同じ分析で染色しますが、一次抗体を省略して二次抗体の非特異的結合をテストします。
   5. 翌朝、PBSで3回、それぞれ5分間スライドを洗浄し、洗浄の合間に溶液を交換します。
   6. 蛍光抗体は光感受性があるため、このステップからは、洗浄容器がホイルで包まれ、ハイブリダイゼーションボックスが黒色または暗闇でインキュベートされるようにすることで、光への曝露を最小限に抑えてください。すべてのスライドで適切な二次抗体をピペットで取り、光密の「湿度チャンバー」(ステップ1.2.1を参照)でブロック溶液(ステップ1.2.3を参照)に室温で60分間インキュベートします(ステップ1.2.1を参照)。
      1. 異なる波長の二次抗体を使用してください。ここで、一次抗体ウサギ抗Iba1については、適切な二次抗体としてロバ抗ウサギ594を用いる。一次抗体マウス抗汎ニューロンには、適切な二次抗体としてロバ抗マウス488を使用してください。あるいは、抗ウサギ488および抗マウス594を使用する。
   7. PBSでスライドを3回、それぞれ5分間洗います。
   8. オプション:核染色を行います。
      1. ヘキスト（または他の核染色)に0.03μg/mlの濃度で二重蒸留H₂Oをきっかり60秒間。
      2. PBSでスライドを3回、それぞれ5分間洗います。
   9. Wash in ddH₂O.
2. Coverslipping
   1. Coverslipは、Fluoromount-GやProlongGoldなどの水性封入剤でスライドします。綿の先端のアプリケーターを使用して、すべての気泡を取り除くように注意してください。
      注：他の封入剤を使用することもできますが、カバースリップから数日以内に染料間の高滲出が指摘されています。
   2. 透明なマニキュアを使用して端を密閉し、蒸発による部分の乾燥を防ぎます。マニキュアを遮光容器で乾燥させ、スライドを平らにして室温に保った後、ホイルで包んだ遮光容器に4°Cで保管します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
材料・設備名
フィッシャーブランド スーパーフロストプラス スライドガラス	フィッシャーサイエンティフィック	22-034-979	組織マウントに使用
オーブン	サーモサイエンティフィック	51028112	ティッシュ乾燥用
ミニパップペン	ライフテクノロジーズ	00-8877
Andwin Scientific Tissue-tek スライド染色皿	フィッシャーサイエンティフィック	22-149-429	染色中のすべての洗浄に使用。 ヘキストステップと同様に
キワイプ	フィッシャーサイエンティフィック	06-666-A	スライドの乾燥に使用
ブラックステインボックス	テッド・ペラ	21050	ブロッキングとステインステップに使用
ノーマルロバ血清	フィッシャーサイエンティフィック	50-413-253	ブロックおよび抗体インキュベーションに使用
マウスα汎ニューロン	ミリポア	MAB2300	一次抗体に使用
ウサギα-Iba1	和光化学工業	019-19741	一次抗体に使用
ロバ α-ウサギ 594	ジャクソン イムノリサーチ	711-585-152	二次抗体に使用
ロバ α-マウス 488	ジャクソン イムノリサーチ	715-545-150	二次抗体に使用抗体
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	カバースリップに使用
カバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック	12544E	カバースリップに使用
Axio Observer.Z1 および LSM 710 (レーザースキャン、 共焦点)	カール・ツァイス	N/A	イメージングに使用
Axioskop A2	カール・ツァイス	N/A	イメージングに使用