脳腫瘍ニューロスフェア切片におけるバイオマーカーの免疫組織化学的染色

要約

出典:Núñez, F. J., et al. Evaluation of Biomarkers in Gliomas by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、パラフィン包埋脳腫瘍ニューロスフェアにおける腫瘍バイオマーカーを標識するための免疫組織化学的手法を示しています。ニューロスフェア切片はパラフィンの除去と再水分補給を受け、その後、バイオマーカー部位を露出させるための治療が行われます。次に、一次抗体と二次抗体を適用して、これらのバイオマーカーを標識します。二次抗体は、アビジン結合ペルオキシダーゼ酵素に結合しており、ペルオキシダーゼ酵素は発色基質を酸化してバイオマーカーの位置を示します。最後に、顕微鏡分析のための核対比染色とスライド調製が完了します。

プロトコル

1. パラフィン包埋ニューロスフェア（NS）の免疫組織化学（IHC）<

1. span style='background-color（透明）color）color）#000000;'>スライドを金属製のラックに入れ、60°Cで20分間インキュベートしてパラフィンを溶かします。
2. 室温(RT)での再水和列車でのインキュベーションによりスライドを脱パラフィン化します：5分間キシレン3個、エタノール100%2分で2分間、エタノール95%2分、エタノール70%1個で2分間、脱イオン水1倍で2分間
。
3. スライドをクエン酸バッファー(10 mMクエン酸、0.05%非イオン性界面活性剤、pH 6)で125°Cで30秒間、90°Cで10秒間インキュベートします。それらを冷ましてから、スライドを蒸留水で5回すすいでください。
4. スライドをRTで0.3%H₂O₂で30分間インキュベートします。
5. スライドを洗浄バッファー（0.025%のトリスバッファー生理食塩水[TBS]に含まれる洗剤)で5分間、穏やかに攪拌しながら3回洗浄します。
6. スライドをRTでブロッキング溶液(10%ウマ血清、0.1%ウシ血清アルブミン[BSA]、TBS)で30分間インキュベートします。
7. 希釈液(TBS中の0.1% BSA)で調製した一次抗体を用いて、加湿チャンバー内でスライドを4°Cで一晩インキュベートします。スライドを洗浄バッファーで3回、穏やかに攪拌しながら5分間洗浄します。
8. 希釈溶液で調製したビオチン化二次抗体を用いて、スライドをRTで1時間インキュベートします。スライドを洗浄バッファーで3回、穏やかに攪拌しながら5分間洗浄します。
9. スライドを暗闇の中で30分間RTでアビジン-ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体とインキュベートします。スライドを洗浄バッファーで3回、穏やかに攪拌しながら5分間洗浄します。
10. スライドを3,3′-ジアミノベンジジン（DAB)-H₂O₂基質ブランドと室温で2〜5分間インキュベートします。
11. 水道水で3回すすいでください。スライドをヘマトキシリン溶液に浸して(1〜2秒)対比し、透明になるまで水道水で十分にすすいでください。
12. スライドを次のように脱水してください：蒸留水で2分間インキュベートし、80%エタノールに3回浸漬し、95%エタノールで2分間ずつ2回インキュベートし、100%エタノールで2分間ずつ2回インキュベートし、最後にキシレンで3分間ずつインキュベー
トします。
13. スライドをキシレンベースの封入媒体で覆い、RTで平らな面で乾燥させてイメージングの準備ができるまで

放置してください。

注:DAB染色を行う場合、スライドはRTで保存することができます。ただし、免疫蛍光染色を行う場合は、光退色を減らすために、スライドを-20°Cの暗所で保存する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Rabbit polyclonal anti-ATRX,Santa	Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 希釈<
Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
ヤギポリクローナル抗ウサギビオチン結合	ダコ	E0432	IHC, 1:1000 希釈<
Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/価格 12/18

td style='height:15.0pt;'>Rabbit polyclonal anti-OLIG2td style='height:15.0pt;'>Vectastain Elite ABC HRP kitまで