透過型電子顕微鏡を用いたマウス脳切片の超微細構造解析

要約

出典:Lutz, D., et.al.発達中のマウス脳および脊髄の子宮内形質導入後の超微細構造神経可塑性パラメータの評価。J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、マウスの子犬の脳切片の調製と透過型電子顕微鏡(TEM)分析を示しています。このプロトコールは、四酸化オスミウムで固定された組織を樹脂に埋め込むことから始まり、精密なトリミングを行って関心領域を分離し、超微分切片を作製して半薄切片と超薄切片を作製し、それぞれ光学顕微鏡とTEMで可視化します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 定量分析のための超微細構造神経可塑性パラメータの選択

1. 関心のある領域のマッピング
   1. 関心のある領域(海馬や小脳など)を選択し、この領域を含むアトラスから画像を選択して、セクションアトラス内の領域を位置特定します。
   2. 対象領域の境界を断面画像にスケッチし、これらの領域の境界を樹脂試料に検索/重ね合わせます。
   3. 樹脂試料上の関心領域(海馬や小脳など)の境界に、細い針ゲージ(26 G、1インチ)を使用してスクラッチマークを付けます。
   4. 樹脂試料をオーブンで85°Cに加熱して樹脂を柔らかくしてトリミングするか、トリミング装置、薄いブレード、またはサンドペーパーを使用します。
   5. 樹脂試料から関心領域をカミソリの刃で切り取ります。必要な口径のアクリルガラス(直径8mm、長さ1cmなど)の保持バーに試料を接着剤で取り付けます。マウントされた試験片をトリミングして、半薄および極薄の切片を作成します。
   6. ウルトラミクロトームを使用して、トリミング領域の半薄(0.75 μm)および極薄(70 nm)の切片を準備します:厚さ0.75 μmの場合は1.5 mm/s、厚さ70 nmの場合は0.7 mm/sに設定します。
   7. ガラスキャリア上の半薄切片を採取し、切片をPBS中の1%トルイジンブルーで染色します(4分間)。
   8. 脱イオン水で切片を数回洗浄します。4倍(NA0.1 ∞/-)、10倍(NA0.22 ∞/0.17)、40倍(NA0.65 ∞/0.17)、および100x(NA1.25 ∞/0.17)の対物レンズを使用して、光学顕微鏡で染色切片を検査します。
   9. ニッケルグリッド上の極薄切片を収集します。グリッドを180kV、3,200倍、6,000倍、および/または8,000倍の倍率でTEMにさらします。
2. TEM解析
   1. 定量的TEM分析に関心のある超微細構造パラメータ(例:小胞とミトコンドリアを持つブートン、有髄軸索と非有髄軸索を含むブートン)を選択し、これらのパラメータのTEM画像を3,500倍、6,000倍、8,000倍の倍率で撮影します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
光学顕微鏡ベーシック DM E	ライカ	-	4x (N. A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
Mosquito hemostatic sersps (12.5cm, curved)	FST	13010-12
ニッケルグリッド、200メッシュ	テッドペラ	1GC200
カミソリの刃	シック	87-10489
Technovit 4004 2つの成分接着剤	Kulzer
薄い振動カミソリ刃装置	Krup	-	サボ薄刃付
トルイジンブルー	シグマアルドリッチ	89640
透過型電子顕微鏡 C20	フィリップス	-	最大 200 kV
Ultracut E	Reichert-Jung	-	Ultramicrotome
Araldite	CIBA-GEIGY	23857.9	組織埋込用樹脂
オスミウム(VIII)-オキシド	デグッサ	73219