マウス海馬ニューロンにおけるシナプス小胞エンドサイトーシスの透過型電子顕微鏡イメージング

要約

出典:Villarreal, S., et.al.、培養海馬ニューロンにおけるシナプス小胞エンドサイトーシスの測定。J. Vis. Exp. (2017)

このビデオでは、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識と電子顕微鏡法による培養海馬ニューロンのシナプス小胞エンドサイトーシスの解析を実演しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

電子顕微鏡

1. HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)を31.5 mM NaCl、2 mM CaCl₂、90 mM KCl、25 mM HEPES(pH 7.4)、30 mMグルコース、2 mM MgCl₂、0.01 mM CNQX、0.05 mM AP5、および5 mg / mL HRPとして高K⁺刺激溶液を調製し、5 M NaOHでpH 7.4に調整します。
   1 です。室温で1.5 mLの高K⁺刺激溶液(K⁺と呼ばれる)で海馬ニューロン培養を刺激し、各ウェルに1.5 mLを90秒間添加します。安静時(Rと呼ばれる)で、同じ濃度の5 mg / mL HRPを90秒間適用しますが、生理食塩水を使用します。.回収サンプルには、K⁺サンプルと同様に高K⁺刺激溶液を適用し、その後迅速に洗浄して通常の生理食塩水と交換し、10分間インキュベートします。
2. 固定と染色
   
   1. pH 7.4の21.4 g/L Naカコジル酸を使用して、0.1 M Naカコジル酸緩衝液を準備します。細胞を0.1 M Naカコジル酸緩衝液中の4%グルタルアルデヒドで室温で少なくとも1時間固定します。0.1 M Naカコジル酸緩衝液でそれぞれ7分間、3回洗浄します。
   2. 0.5 mg/mL の DAB と 0.3% H₂O₂ in ddH₂O からなるジアミノベンジジン(DAB)溶液を調製し、0.22 μm フィルターでフィルターします。1.5 mLのDAB溶液を37°Cで30分間適用し、0.1 M Naカコジル酸緩衝液で3回、それぞれ7分間洗浄します。
      注意:DABは有毒で発がん性が疑われる物質です。手袋と白衣を使用してください
      注:DABによる標識は、HRPによって触媒されるH₂O₂による酸化により発生します。成分がわずかに増加すると、サンプル内の信号が増加します。HRPの濃度を上げると、触媒の効果が速くなります。H2O2の濃度が十分に高いと、HRPによる副反応を衰弱させ、標識³²の効果を阻害する。この研究では、この標識システムの濃度は、現在利用可能な研究に基づいて選択されました。
   ニューロン
   3. を1.5 mLの1% OsO₄ in 0.1 M Na cacodylateバッファーで4°Cで1時間インキュベートします。0.1 M Naカコジル酸緩衝液1.5 mLで3回、それぞれ7分間洗浄します。
      注意:OsO₄の毒性と反応性により、多くの場合、サンプルを化学フード内の氷上に保管することは、インキュベーションに冷蔵庫を使用するよりも好ましいです。
   4. 0.1 M 酢酸ナトリウムバッファーを 13.61 g/L 酢酸ナトリウムと 11.43 mL/L 氷酢酸 (pH 5.0) で調製します。pH 5.0 の 1.5 mL 0.1 M アセテート緩衝液で 7 分間 3 回洗浄し、1.5 mL 1% 酢酸ウラニル 1% 酢酸 0.1 M アセテートバッファー (pH 5.0) で 4 °C で 1 時間インキュベートします。1.5 mL 0.1 M アセテート緩衝液で 3 回、各 7 分間洗浄します。
      
3. エポキシ包埋 < br />
   1. ニューロン培養物を50%、70%、および90%エタノールの1.5 mLをそれぞれ7分間1回洗浄し、次にヒュームフード内で1.5 mL 100%エタノールをそれぞれ7分間3回洗浄して脱水します。
   2. 485 mL/L ビスフェノール-A-(エピクロルヒドリン)エポキシ樹脂、160 mL/L 無水コハク酸(DDSA)、340 mL/L メチル-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボン酸無水物(NMA)、15 mL/L 2,4,6-トリス(ジメチルアミノメチル)フェノール(DMP-30)を混合してエポキシ樹脂を作製します。十分に混合し、真空下で保管して気泡を取り除きます.
      注:樹脂内の気泡、特に肉眼で見えるよりも小さい気泡は、切片化中に樹脂に空洞を引き起こす可能性があるため、除去することが重要です。
   3. エタノールをエタノール中の50%エポキシ樹脂とエタノールで室温で30分間シェーカーで交換し、次に70%エポキシ樹脂をエタノール中で室温で30分間シェーカーで置き換えて、サンプルを浸潤します。
   4. エポキシ樹脂溶液を100%エポキシ樹脂に交換し、50°Cで10分間インキュベートします。新鮮な100%エポキシ樹脂を2回交換し、50°Cで1時間インキュベーションします。新鮮な100%エポキシ樹脂を加え、50°Cで一晩硬化させ、次に60°Cで36時間以上硬化させます。
4. 各サンプルをマルチウェルプレートから宝石商のハンドソーで取り出します。倒立型光学顕微鏡を使用して、関心領域、細胞の密集した濃度を選択し、ミクロトームによる切片化のために70〜80 nmのブロックを切断します。ミクロトームチャックにカット領域を装着し、ミクロトームをロードします。チャックをミクロトームに配置し、エッジがブロックの表面と平行になるようにダイヤモンドナイフを取り付けます。厚さ70〜80 nmの切片を個々のグリッドに直接収集します。
5. 酢酸ウラニルを水に溶かして重量比1%の溶液にし、クエン酸鉛を水に別途溶解して重量比3%の溶液にします。1%酢酸ウラニル水溶液で15分間浸漬し、次に3%クエン酸鉛水溶液で5分間浸漬して、サンプルのコントラストを改善します。
6. EMイメージング
   1. 透過型電子顕微鏡で切片を検査し、CCDデジタルカメラで10,000-20,000倍の一次倍率で画像を記録します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
神経基礎培地	サーモフィッシャー	21103-049	ニューロン用増殖培地、使用前に37°Cまで温めてください
B27	サーモフィッシャー	17504-044	ニューロン分化のための勾配
グルタマックス	サーモフィッシャー	35050-061	ニューロン培養の勾配
ウシ膵臓からのトリプシンXI	シグマ	T1005	ニューロン培養消化海馬組織
ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼI	シグマ	D5025	ニューロン培養-粘性細胞を阻害する懸濁液
ポリ-l-リジン	シグマ	P4832	電子顕微鏡法、ニューロン成長のための基質、マルチウェルプレートに室温で1時間適用し、滅菌水で3回洗浄します
西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)	シグマ	P6782	電子顕微鏡、 過酸化水素の存在下でDABを触媒することにより、エンドサイトーシスされたシナプス小胞の標識、最終濃度は生理食塩水で5 mg / mL、使用前に新鮮にしてください
カコジル酸ナトリウム	電子顕微鏡科学	12300	電子顕微鏡、固定剤および洗浄用バッファー、 最終濃度は0.1N
3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)	シグマ	D8001	電子顕微鏡、エンドサイトーシスされたシナプス小胞の標識、HRPの基質、最終濃度は重水素減少水で0.5mg/mLでろ過され、使用前に新鮮に作る
過酸化水素溶液	Sigma	H1009	電子顕微鏡、HRP-DAB反応を誘導することによるエンドサイトーシスシナプス小胞の標識、最終濃度は重水素減少水で0.3%、使用前に新鮮に作る
グルタルアルデヒド	電子顕微鏡科学	16365	電子顕微鏡、固定剤、最終濃度はNa-カコジル酸緩衝液中で4%です。 使用前に新鮮にし、よく振って使用してください
TEM	日本電子	200CX	電子顕微鏡、エンドサイトーシス小胞および超微細構造変化のイメージング
CCDデジタルカメラ	AMT	XR-100	電子顕微鏡、 画像の撮影
クエン酸鉛	ライカマイクロシステムズ	16707235	電子顕微鏡、グリッド染色