トランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

要約

出典:Breid, S., et.al. α-Synuclein Fibrilsの末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング。J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、トランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージングを実演し、活性化アストロサイトにおけるルシフェラーゼ-ルシフェリン反応を示しています。このプロトコルは、アストロサイト活性化の非侵襲的な定量化を可能にし、CNSの炎症と治療効果に関する研究を支援します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設の動物管理委員会とJoVE獣医学審査委員会によってレビューされています。

Animal Model

1. インタークロスヘミジグスTg(Gfap-luc+/-)マウスとヘミジガスTg(M83+/-)マウスを使用して、ヘミジガスバイジェニックTg(M83+/-:Gfap-luc+/-)マウスを生成します。
2. ヒトα-シヌクレインをコードする導入遺伝子の存在をリアルタイムPCRで、ホタルルシフェラーゼの標準PCRで子孫をジェノタイプします。
3. 6〜8週齢で動物に接種してください。

Inoculum Preparation

1. 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) に 150 mM NaCl を含む Tris-buffered saline (TBS) buffer in Tris-buffered saline (TBS) buffer in the A53T mutation with monomeric recombinant human α-synuclein in the 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) を調製します。
2. 3 μg/μLのモノマー組換えヒトα-シヌクレインをオービタルシェーカーで800 rpm、37°Cで5日間攪拌することにより、接種用の線維性α-シヌクレインを準備します。
3. 腹腔内接種の最終濃度1 μg/μLに達するために、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でフィブリル集合体を希釈してください。
4. 氷上でアルファシヌクレイン線維をロッドソニケーターで1分間フラグメント化します（0.5秒の持続時間を40パルス、各パルスと振幅の間に1秒の一時停止を挟む）。クロスシードによる汚染を避けるため。清潔な超音波処理プローブを使用して、さまざまな接種材料を調製します。

腹腔内注射<

1. span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>腹腔内注射の場合、麻酔室ですぐにイソフルラン/酸素を吸入し、流量を2 L/minにし、気化器を2%に設定して動物を麻薬化します。動物のつま先をつまんで、適切な麻酔を確保するために後肢を引っ込めないことを確認します。
2. 27 Gの使い捨て皮下注射器に、50 μLの超音波処理されたα-シヌクレインフィブリルまたはPBSを入れてください。
3. マウスの腹膜に直接注入し、腹壁の後ろにある小腸や盲腸に侵入しないように、動物を背側の位置に保持し、頭部を研究者から遠ざけ、約45°下に向けてください。動物が麻酔から回復するまで動物を監視します。

< style='background-color:transparent;color:#1a202c;'生物発光イメージング

1. Image Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) マウスを生物発光イメージングシステムを使用して2〜4週間ごとに
観察します。
2. イメージングする前に、流量2 L/min、気化器を2%に設定したイソフルラン/酸素チャンバーでマウスに麻酔をかけてください。動物のつま先をつまんで、適切な麻酔を確保するために後肢を引っ込めないことを確認します。
3. 脱毛クリームでマウスの頭を剃り、脱毛します。非特異的な生物発光をブロックするために、刺激性のないマーカーで耳を黒く着色します。
4. ルシフェラーゼの基質であるD-ルシフェリンカリウム塩をPBSで30 mg/mLのストック溶液に希釈します。これを-20°Cで1mLアリコートに保管し、溶解したD-ルシフェリンを光にさらさないように保護します。
5. 注射前に動物の体重を量ります。150 mg / kg体重の注射用のD-ルシフェリンの正確な量を計算します。.D-ルシフェリンを腹腔内に注射し、動物を麻酔室に戻します。
6. イメージングソフトウェアを起動します。イメージングシステムが動作温度に達したら、コントロールパネルの[初期化]ボタンをクリックしてシステムを初期化します。
7. 'Luminescent' と 'Photograph' ボタンを選択してください。露光時間を60秒、ビニングを「中」、F /ストップを「1」、EMゲインを「オフ」に設定します。
8. 励起フィルタが'Block'に、発光フィルタが'Open'に設定されていることを確認し、被写体の高さを1.50cmに設定してください。
9. D-ルシフェリンを注射してから10分後に、動物をイメージングチャンバーの加熱プレートに置き、彼らの銃口が麻酔口に正しく配置されていることを確認してください。吸入チャンバーからのイソフルラン/酸素の流れを閉じ、0.25 L / minの流量と2%の蒸発でイメージングチャンバーへの流れを開きます。イメージングチャンバーのドアを適切に閉めてください。
10. '取得」ボタンをクリックして、生物発光を測定してください。これには60秒かかります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
27ゲージ注射器	VWR	613-4900
イソフルラン	ピラマルヘルスケア	PZN 4831850
脱毛クリーム	Veet
セキュアラインラボマーカー	ネオラボ	25040
D-ルシフェリンカリウム塩	アクリス	LK10000	30 mg/mL 原液
サーモミキサー	エッペンドルフ	5776671
ソノパルス Mini20 ソニケーター	バンデリン	3648
IVIS Lumina II イメージングシステム	パーキンエルマー
Living Image 3.0 ソフトウェア	パーキンエルマー
Tg(M83+/-) マウスまたは B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/Jマウス	ジャクソン研究所	4479