蛍光親油性色素を用いたショウジョウバエ運動ニューロンの逆行性標識

要約

出典:Inal, M. A. et.al., 親油性蛍光色素を使用したショウジョウバエ胚運動ニューロンの逆行性トレース。J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、親油性色素を使用してショウジョウバエ運動ニューロンを逆行性標識する方法を実演しています。色素は軸索に入り、逆行性に移動し、ニューロンを緑色に標識し、共焦点顕微鏡でニューロンの形態と投影を詳細に視覚化できます。

プロトコル

1. 備品と備品

1. 胚を収集し、成虫が卵を産むための訓練のための材料<ol style='list-style-type:decimal;'
2. 50mLのチューブを切断し、キャップに穴を開けて100μmのメッシュフィルターをセットして、ろ過装置を準備します。(材料の表)チューブとキャップの間にあります。
   注:あるいは、100 μmの細孔を持つ細胞ストレーナー(材料の表)を胚収集のろ過ステップに使用することができます。
3. 記載されている指示に従って、ブドウの寒天プレミックス(材料の表)で寒天プレートを作成します。簡単に言えば、粉末混合物の1パケットを500 mLの室温(RT、23°C)蒸留水(dH₂O)に穏やかに攪拌し、溶解した混合物を電子レンジで激しく沸騰させます。70−75°Cに冷却した後、混合物をペトリ皿(60mm)に注ぎます。寒天が固まった後、プレートを4°Cで保存します。
4. 活性ドライイースト（Table of Materials）と水をペースト状に混合してイーストペーストを準備し、4°Cに保ちます。
5. 十分な空気の流れを提供する卵収集ケージ（60mmシャーレ用、材料表）を使用してください。
   

解剖針と染料注入マイクロピペットの準備

1. 内径0.6mm、外径1.2mmの同じ毛細管から染料注入マイクロピペットと解剖針を準備します(材料表).マイクロピペットプーラーでキャピラリーチューブを最大出力170Vから7%で引っ張ります(材料表)と、長さが~0.4cmのテーパーを持つ鋭い針を作ります。
2. 染料注入のために、機器のマニュアルに記載されている泡の面取り技術で面取りされたマイクロピペット（材料表）でマイクロピペットを調整してください。
   1. <>span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>要するに、水が針先を「引きずる」のを防ぐために、グラインダーを湿潤剤(Table of Materials)に浸します。針をマイクロピペットクランプに25〜30°で置き、先端を面取り面の中心から半径の3分の2外側に下げます。チューブ付きのシリンジで針に空気を押し込みながら針を研磨し、マイクロピペットにガラスの削りくずが付着しないようにします。
   2. 斜めに形成されたマイクロピペットの狭い開口部を見つけるのは難しいため、斜角にした後の先端の開口部の位置を示すために、マイクロピペットに細い先端の油性マーカーを印

を付けてください。

< style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>2. 胚収集

1. の準備成虫のハエ(野生型のカントンSまたはコナガバエ20−40匹)が、理想的な卵収集のために若<くて健康な状態で維持されていることを確認してください。
   注：産卵を刺激するために、ハエは卵収集の数日前に、少なくとも毎日一度は酵母ペーストをまき散らした寒天皿の上で卵収集ケージで訓練されます。

3. 胚のステージング

1. ハエが一晩中(または少なくとも15時間)卵を産むのをRTで許可し、産卵後15時間（AEL）、すなわちステージ16で胚を採取し、前角細胞（aCC）および生エビ3）運動ニューロンの樹状突起形成を観察します。午前中は、卵と一緒に皿を集めます。
   注：15時間のAELの胚は、明確な4チャンバーの腸を持ちます。イメージングのために、さまざまなステージが特定の形態学的基準と老化条件に従います。
2. 胚を採取するには、プレートに産まれた卵を50%漂白剤で5分間デコリオネートします。
3. 絨毛膜がクリアになったら、プレートの内容物をろ過装置または細胞ストレーナーに注ぎ、胚を分離します。スクイーズボトルの水を使用して、プレートに残った漂白剤を希釈し、混合物をフィルターにデカントしてできるだけ多くの胚を集めます。
4. フィルター上の胚を3〜4倍に水で洗うか、漂白剤の臭いが消えるまで洗ってください。装置からフィルターを取り外し、胚を別のきれいなプレートに水で洗います。胚が置かれている新しいプレートから水をデカントします。
5. 中央にビニールテープを2枚重ねてガラスのスライドを準備し、長方形を形成します。かみそりの刃を使用して、テープから長方形のプールを切り取ります。両面テープの細いストリップをプールの上端に向けて置き、図1に示すように胚が配置されます。
6. 細かい鉗子を使用して、15時間のAELで5−10個の胚を個別に選択し、背側を上にして両面テープの上に置きます。昆虫のリンガー生理食塩水を解剖プールに追加して、胚を乾燥から保護します(図1)。

4. 解剖と染色

1. 解剖顕微鏡(Table of Materials)の下でガラス針を使用し、単一の胚の表面の後端から前端まで正中線を切り取ります。次に、胚をテープからガラス(図1の枠)に引きずり出します。胚の内部組織を傷つけないように注意してください。
2. 上皮組織を中心から反転させ、表皮の端をスライドガラスの表面に取り付けます（図1、挿入図)。
3. 先端が~300μmのチューブ接続針を使用して(解剖針の細い先端を折って準備)、吸引または空気を吹き付けて背側縦気管幹と残りの腸を取り外して除去します。
4. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に含ませて、RTで胚を5分間固定します。
5. 200 μLのPBS中にシアニン3色素（抗HRP Cy3））(材料表)を結合させた抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体1μLで胚を1時間染色してください。染色後、胚をPBSで3回洗浄してください。
   注:抗HRPの色素は、注射用に選択した親油性色素に基づいて変更することができます。

5. インジェクションマイクロピペットの充填

1. 熱親油性染料(5 mg/mLの3,3'-ジオクタデシロキサカルボシアニン、過塩素酸塩(DiO)または1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニン、4-クロロベンゼンスルホン酸塩(DiD)、材料表)使用前にエタノール:植物油の1:10混合物で60°Cまで。
2. 注入マイクロピペット用の油溶染料スライドを準備してください。マイクロピペットをキャピラリーホルダーに入れます(図2、#1)。マイクロマニピュレーター(材料表)を使用して、マイクロピペットを染料スライド上に合わせます。次に、ステージを調整してマイクロピペットを色素の上に置きます(図2、#2)。
3. マイクロピペットをいっぱいにするには、マイクロインジェクター（Table of Materials））（図2、#3）を使用してください。P_i(注入圧力)を200-500 hPa(ヘクトパスカル)、T_i(注入時間)を0.1-0.5 sからP_c(補償圧力)に5分間設定して、マイクロピペットに色素を回収します(図2、#4)。
4. 染料が収集されたら、染料スライドを取り除き、サンプルを顕微鏡ステージに置きます。次に、マイクロピペットをサンプルに下げる前に、Pcを20-60hPaの範囲に増やして、毛細管現象によるPBSの汚染を防ぎます。

6. ニューロン

1. への色素注入10倍対物レンズ(Table of Materials)を備えた顕微鏡を使用して胚を中央に位置合わせし、マイクロピペットを胚に合わせます。
   注：色素の液滴のサイズは、Piまたはマイクロピペット先端の開口部のサイズを変更することで調整できます。液滴は10-20μmで、これは約1筋肉の幅です。
2. 対物レンズを水浸40倍レンズ(Table of Materials)に変更し、レンズをPBSに沈めて胚を見てください。
   1. 蛍光顕微鏡を使用して、抗HRP Cy3によってマークされたニューロンの形態を確認し、注射部位を特定します。
   2. 注入中は、明視野顕微鏡を使用して染料の液滴を確認してください。胚に焦点が合ったら、マイクロピペットの位置を変更して、目的の軸索(aCC、RP3など)の先端に穏やかに接触させます。
   3. aCCまたはRP3（）（図3）の神経筋接合部にある右腹部（A2−A6）の半分節に、DiDまたはDiOのいずれかで染料を滴下します。これは、抗HRP Cy3によってマークされたニューロンを使用して行います。ハンドコントロール(マウス;図2、5)マイクロマニピュレーターで色素を滴下した後、色素を放出し、マイクロピペットを取り出して次の注入部位に移ります。
      注：他の色素（例えば、ルシファーイエロー、カルセイン〉とは異なり、親油性色素は細胞膜と結合し、隣接する細胞には移動しません。しかし、色素液滴のサイズが比較的大きいため、この手法ではパートナー筋の標識も得られます(図3A)。
3. イメージングする前に、色素滴下後1時間RTでサンプルをインキュベートしてください。
   注:プロトコルは、マウントする前にここで一時停止することができ、サンプルは一晩4°Cに保つことができます。親油性色素は、細胞内直接共役(DC)増幅器がすぐに利用できる場合は、イオントフォレーシスを使用して送液することもできます。

7. 共焦点顕微鏡

1. によるイメージング鉗子を使ってスライドガラスから両面テープとビニールテープを取り除きます。
2. カバースリップ(22 x 22 mm2 No.1カバーガラス)を少量の真空グリース(材料表)で四隅に用意し、気泡を避けて慎重にサンプルの上に置きます。タスクワイパーを使用して余分なPBSを取り除きます。
3. 対物レンズとサンプルの間の作動距離を調整するために、カバースリップを押し下げてください。カバーガラスの端をマニキュアで完全に密封します。
4. 共焦点顕微鏡を使用して10倍と100倍の倍率で画像を表示します。

結果

図1:解剖プールのセットアップ。スライドガラスに見られる青いチャンバーは、バッファーを内部に保持するビニールテープで作成されています。両面テープは、適切に位置合わせされた胚を保持します。また、左下隅には、生理食塩水で解剖された胚の例が示されています。前端は、この図と後続のすべての図の上部にあります。

材料

ナイロンネットフィルターVWR セルストレーナー<td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>VWR

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10倍対物レンズ	ニコン		Plan
40倍水没レンズ	ニコン		NIR Apo
毛細管	Frederick Haer&Co	27-31-1
共焦点顕微鏡	Andor	N/A	Dragonfly Spinning disk 共焦点ユニット
カバーガラス	Corning
DiD	ThermoFisher	V22886	<
ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
解剖顕微鏡	ニコン	N/A	SMZ-U
両面テープ	スコッチ	665
ダウコーニング高真空グリース	フィッシャーサイ.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	ファインサイエンスツール	11252-20
FlyStuff	59-100<
FemtoJet 5247	Eppendorf	廃止	FemtoJet 4i (カタログ番号 5252000021)
マイクロマニピュレーター	Sutter	MP-225	<
Sutter	BV-10-B
ニードルプラー	Narishige	PC-100
-fly ぶどう寒天粉末プレミックスパケット	FlyStuff	47-102
Millipore
パラホルムアルデヒド16%溶液、EMグレード	電子顕微鏡科学	15710	任意のEM
PBS	Roche	11666789001	sigmaaldrichで販売、ボックス化された10xソリューション
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	wettting agent
直立蛍光顕微鏡	ニコン	N/A	Eclipse Ci with a LED light source
ビニール電気テープ	スコッチ	6143
10199-659
FlyStuff	62-103	アクティブドライイースト (RED STAR)

style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>22x22 mm Square #1td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>DiItd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>卵収集ケージtd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>マイクロピペットベベラーグレードtd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Yeast