末梢血由来細胞から分化した神経細胞の免疫蛍光顕微鏡法

要約

出典:Becker-Kojić, Z. A., et al., GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells.J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、再プログラムされた末梢血細胞から得られた神経細胞を蛍光顕微鏡用に調製するプロトコルを示し、免疫蛍光イメージングを通じて異なる細胞タイプと発生段階を紹介しています。

プロトコル

1. 血液由来神経細胞の免疫蛍光顕微鏡分析
   1. 細胞を16日間培養し、培地を除去します。
      1. 75 mLの滅菌水、4 gのパラホルムアルデヒドからなる予め加温した固定液でインキュベートします。必要に応じて10 N NaOHを加え、溶液が透明になるまで撹拌します。次に、10x PBS10 mL、MgCl₂、0.5 M EGTA2 mL、ショ糖4 gを添加します。6 N HClでpH 7.4に滴定し、滅菌水100 mLで15分間加熱します。
      2. 固定液を廃棄し、細胞を5分間ずつ3回洗浄します。すぐに作りたての0.3%Triton X溶液を添加し、細胞を5分間透過処理します。PBSで3回洗浄し、PBSと5%BSAで作られたブロッキング溶液を追加します。
      3. ロッカープレート上で室温で細胞を1時間ブロックします。
      4. 1% BSA/PBSで抗体を適宜希釈して調製し、抗体希釈液をロッカープレート上で室温1.5時間インキュベートします。細胞をPBSで各5分間3回洗浄し、DAPIで細胞をインキュベートし、カバースリップを封入剤でマウントして顕微鏡で可視化します。
         注:この実験で使用した直接標識抗体は、Table of Materialsに記載されています。

材料