蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いた組織切片のアミロイド構造の解析

要約

出典:Nyström, S., et al., ハイパースペクトル共焦点顕微鏡法および蛍光寿命イメージングによる発光共役オリゴチオフェンで染色されたアミロイド組織イメージング。J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、hFTAA色素を使用して、アミロイド構造を蛍光寿命イメージング顕微鏡またはFLIMで解析し、アミロイド組織を反映して、色分けされた画像でコンパクトなコアを青/緑、不安定な周辺を赤/黄色で明らかにする方法を示します。

プロトコル

1. 組織サンプルの調製

注: 多くの組織タイプは、アミロイドマーカーとしてヘプタメルホルミルチオフェン酢酸(hFTAA)を使用してイメージングできます。hFTAAは凝集体構造に敏感です。したがって、染色は、好ましくは、エピトープ曝露のない中断されていない凝集体に対して実施されるべきである。組織の固定が最小限に抑えられている場合、最適なスペクトル品質が達成されます。したがって、染色時にエタノールに穏やかに固定された新鮮な凍結材料が好ましい。しかし、、例えば、ホルマリンで固定された組織でもアミロイド沈着物を検出することは可能です。hFTAAは一般的に組織によく浸透します。目的のイメージング技術に適した試料の厚さを選択します。

1. ホルマリン固定パラフィン包埋切片を使用する場合は、キシレンで一晩脱パラフィンする必要があります。次に、切片を99%エタノール、70%エタノール、dH₂O、およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の連続浴にそれぞれ10分間浸します。ティッシュ切片を周囲条件下で乾燥させます。
   注意:キシレンは常に化学ドラフトで取り扱われます。キシレンやその他の有機溶剤は有害です。
   1. 凍結切片を室温で解凍します。組織切片を10%ホルマリンで一晩固定し、99%エタノール、70%エタノール、dH₂O、PBSの連続浴にそれぞれ10分間浸して再水和します。ティッシュ切片を周囲条件下で乾燥させます。
2. hFTAAワーキング溶液(約200μL)の液滴を組織切片に加えて覆います。液滴は表面張力によって所定の位置に留まる必要があります。室温で30分間インキュベートして染色します。
3. ピペットを使用して500 μL PBSで染色液を洗い流し、スライドをPBS浴に10分間浸します。セクションを周囲条件下で乾燥させます。
4. 蛍光封入剤を使用してマウントします。埋込媒体が一晩沈殿するのを待ちます。

2. FLIM
注: 共焦点顕微鏡には、蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)ユニットが装備されています。

1.共焦点顕微鏡の次のパラメータを設定します:ピンホール、20;励起波長、490 nm;レーザー強度、0.5%(平均出力7.5μWに相当)。40 MHz のパルス レーザーを使用します。

2.FLIMソフトウェアで、550nmを超えるフォトンカウンティングを設定します。[表示パラメーター] ウィンドウで、[最大カウント] が約 4,000 フォトン カウントになるまでフォトン カウントに従います。

3. ファイルを保存し、単一フォトンカウンティング(SPC)画像としてエクスポートします。

4. FLIMソフトウェアでデータを2成分指数減衰に適合させます。χ² < 2 を与える近似は良いです。y 軸の値は、指定されたライフタイムのカウント数です。

5. カウントに含めるしきい値 (、例: 、100) を選択します。T1で色分けし、寿命範囲を選択します。崩壊は、hFTAAが結合しているアミロイド構造に依存します。300〜1,000psの蛍光寿命が観察されています。ファイルを保存します。

6.エクスポートオプションを使用して生データをエクスポートし、目的のデータを新しいフォルダーに保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
hFTAA/Amytracker545	エババイオテクノロジー
ダコ蛍光体実装媒体	アジレントテクノロジーズ	GM304
ライカDM6000	ライカ
ルーメン 200	Prior
Spectraview system	ASI spectral imaging
Spectraview software	ASI spectral imaging
LSM780	ツァイス
Zen 2010b v6.0 ソフトウェア	ツァイス
FLIM system	ベッカー&ヒックル
Ar/ML 458/488/514	ツァイス
チューナブルレーザーインチューン	ツァイス