デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス初代視床下部ニューロンにおけるGLUT4タンパク質輸送のイメージング

要約

出典:Changou, C. A., et.al. デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス初代視床下部ニューロンにおけるGLUT4タンパク質輸送のライブ画像。J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、視床下部ニューロンにおけるインスリン誘発性GLUT4転座のイメージングを紹介し、デコンボリューション顕微鏡を用いてGFP-GLUT4の輸送ダイナミクスを高解像度で捕捉および解析します。

プロトコル

1.Live 画像記録

1. ライブイメージング用細胞の準備

1. 6ウェルプレートにポリD-リジンがプレコートされた#1.5(または厚さ0.17mm)のガラスカバースリップ上で緑色蛍光タンパク質標識グルコーストランスポーター4（GFP-GLUT4）を発現する視床下部ニューロン細胞を培養します。

2.ニューロンの入ったカバースリップを鉗子で慎重に取り外し、注意してスライドガラスの上に置きます。

3.繊細なタスクワイプで余分な媒体/液体を取り除きます。ワイプを2回折り、カバーガラスの上に慎重に置きます。カバースリップを動かさずにワイプをそっと押し下げます。
注意: カバースリップをスライドガラスに強く押し付けないでください。このステップの目的は、浮力による画像取得中にカバーガラスが移動/ドリフトしないようにすることです。

4. カバースリップとスライドをデコンボリューション顕微鏡ステージに置き、カバースリップを下に向けて適切に固定します。この手順は、スライド位置が一定に保たれ、ユーザーが後で同じターゲット セルのセットを追跡できるようにするためのものです。

5. WTおよびCCR5-/-視床下部ニューロン細胞を60倍/1.42NA油浸対物レンズで観察します。

6. 選択した細胞サンプルをCCL5(10 ng/mL)またはインスリン(10 U/mL)で1分間処理し、カバーガラスの端に希釈したインスリン1.5 μLを加えます。

7.選択した細胞サンプルをすぐに視覚化して記録します。ビデオ録画ソフトウェアをプログラムして30分間録画します。

2. デコンボリューション顕微鏡と分析
注: プロトコルのこの部分では、分析のためにデコンボリューション顕微鏡と専用ソフトウェアを使用する必要があります。

1.イメージングシステムの電源をオンにし、顕微鏡ステージが適切に初期化されるのを待ってから、LED光源をオンにします。

2. 60x 1.42 NAの対物レンズに液浸油(37°Cの生試料で屈折率1.520)を加えます。サンプルスライドをカバーガラスを対物レンズに向けて顕微鏡に置き、スライドを適切に固定します。

3. 明視野照明または蛍光照明を使用して、標的細胞を同定します。ターゲット細胞がはっきりと観察できるようになるまでピントを調整します。不必要な傷跡を避けるために、対物レンズをカバーガラス領域の外に動かさないでください。

4. GFPシグナルにより、緑色蛍光タンパク質標識グルコーストランスポーター4(GFP-GLUT4)を同定します。画像取得に必要なターゲット細胞を同定します。選択したターゲット細胞の位置は、後で参照するために記憶することができます(図1を参照)。

5.各ターゲットセルに適切な実験パラメータ(ピクセル番号、励起波長、透過率、露光時間、スタックの厚さ、時間間隔、および合計イメージング時間を含む)を設定します。この実験では、GFP信号の画像ピクセル数を512 x 512に設定しました(高解像度の場合は1,024 x 1,024に設定できます)。露光時間は、5分ごとに0.025〜0.05秒の間で設定されました。横方向のx、y、zの微調整は、推奨ソフトウェアで制御できます(マテリアルテーブルを参照)。

6.露出パラメータを約2,000〜3,000カウントに設定して、最大のピクセル強度を実現します。蛍光光退色を最小限に抑えるには、露光時間を1秒未満に保ちながら、励起光の透過率をできるだけ減らします。追加の蛍光チャネルおよび個々の関心領域ごとに、これらの手順を繰り返します。

7. 各ターゲットセルのZスタックの上限と下限を設定します。これは、標的細胞の上部と下部がともにわずかに焦点が合っていない状態になるまで顕微鏡ステージを動かすことで実現できます。ユーザーは、上限と下限の間の画像数を設定することにより、Z軸の解像度を調整できます(これは、各画像間の距離を設定することで実行できます)。

8.画像のスタックはデコンボリューションされ、後でそれぞれのソフトウェア(この場合はPerkinElmerのVelocity)を使用して分析されました。

結果

図1:視床下部ニューロンにおけるGFP-GLUT4のスナップショット。(A、C)野生型(WT)視床下部ニューロンおよび(B)CCR5-/-視床下部ニューロンで発現するGFP-GLUT4タンパク質。ニューロンはインスリン(A、B)またはCCL5(C)で刺激されました。矢印は、(+)インスリンまたはCCL5刺激の前後(+)の神経炎におけるGFP-GLUT4点状を指し、アスタリスクは(C)のCCL5刺激前(+)のGLUT4-GFP表面を指しています。

材料