免疫蛍光法を用いたマウス海馬切片のシナプスの顕微鏡解析

Abstract

出典:McLeod, F., et al.海馬のげっ歯類の脳スライスにおけるシナプス密度の評価。J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、共焦点免疫蛍光分析を使用して海馬の脳切片のシナプスマーカーを視覚化する方法を示します。スライスは、シナプス前およびシナプス後マーカーを標的とする一次抗体で免疫染色され、続いて蛍光色素標識二次抗体で免疫染色されます。次に、標識されたマーカーを共焦点顕微鏡を使用して視覚化し、共局在化を通じてシナプス構造を評価します。

Protocol

動物サンプルを含むすべての手続きは、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.Acute Hippocampal Slice Preparation

1. できるだけ早くマウスの脳を取り出し、ヘラと鋭利なハサミを使って頭蓋骨を切断し、酸素化(95% O₂、5% CO₂)、高スクロース人工脳脊髄液(ACSF、~100mL)で氷冷した状態に置きます。
2. マウスの脳をシャーレの上に置き、脳の正中線を半角化する前にメスで小脳と前頭皮質の小さな部分を取り除きます。
3. ちょうどカットした面に2つの半球を置き、各半球をビブラトームのステージに接着します。
4. 関心のある領域全体を200〜300μmの厚さのセクションにカットします。海馬の場合、半球あたり約3〜4スライスが得られるはずです。
5. プラスチックパスツールピペットを使用して、スライスを酸素化(95%_O2、5%_CO2)ACSFに浸したチャンバーに移します。34°Cで30分間維持します。
   注：この段階では、スライスは、組換えDickkopf-1(Dkk1)タンパク質などの活性薬理学的薬剤で、スライスチャンバーに薬剤を添加することにより、処理することができます。
6. 絵筆を使用して、スライスをチャンバーから取り出し、24ウェルプレートに入れ、室温(RT)で4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4%スクロースに20分間から1時間固定します。
   注意：PFAは有毒ですので、適切な保護具を着用してください。
7. スライスを1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS、各10分)で3回洗浄します。
   注:スライスが1X PBSで4°Cに保たれている限り、プロトコルはここで1〜2日間一時停止できます。

2. シナプスマーカーの免疫蛍光

注:使用したすべてのバッファーのレシピは表1にあります。

スライスウェルで、PBSをブロッキング/透過化バッファー（表1）に交換し、RTで4〜6時間インキュベートします。

2. ブロッキング/透過化バッファーで、小胞性グルタミン酸トランスポーター1（vGlut1）に対するポリクローナルモルモット抗体を1:2,000希釈で希釈してください。
   注:vGlut1は、シナプス前興奮性終末の視覚化のためのマーカーです。シナプス後興奮性シナプスの同定には、シナプス後密度-95(PSD-95)に対するポリクローナル抗体を使用し、同じ溶液で1:500に希釈します。各ウェルには300μL以上の容量を使用してください。海馬の解剖学的位置を特定するには、微小管関連タンパク質2(MAP2)やチューブリンなど、ニューロン構造も同定できる抗体を使用します。選択したシナプスマーカー(シナプス前およびシナプス後)のすべての一次抗体の正しい濃度を計算し、新鮮なブロッキング/透過化バッファーで希釈します。
3. 一次抗体溶液でスライスを一晩(または1〜2日間)4°Cでインキュベートします。 激しく動く振とう台を使用してください。
4. PBSでスライスを3回(それぞれ10分)洗います。
5. ブロッキングバッファー内の適切な二次抗体を1:500に希釈してください。例えば、vGlut1モルモット抗体を使用する場合は、特定の蛍光色素に標識されたモルモット成分(例:ロバ抗モルモット)を認識する二次抗体を適用します。PSD-95ウサギ抗体を使用する場合は、ウサギの成分を認識する二次抗体(例:ロバ抗ウサギ)を異なる特異的蛍光色素に結合させて適用してください。
6. この溶液でスライスをRTで2〜3時間インキュベートします。二次抗体は光感受性であるため、スライスが光から保護されていることを確認してください。
7. PBSでスライスを3回(それぞれ10分)洗います。
8. 絵筆を使用して24ウェルプレートからスライスを慎重に取り除き、事前にラベル付けされたスライドガラス上に均等に配置します。各スライスの上に封入剤を一滴加え、スライスの上にガラスカバースリップをそっと置きます。気泡の形成を避けてください。十分な封入剤(300-400μL)をご使用ください。量が不足するとスライスが乾燥する恐れがありますので、ご注意ください。
9. RTで最低1〜2日間乾燥させ、スライドを光から守ってください。
10. スライドを短期的には4°Cで保管しますが、長期保管の場合は-20°Cに保ちます。

3. 共焦点画像の取得と分析

1. 共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用したイメージング。
   1. 画像化する海馬の領域を特定します（例えば、10倍または20倍の対物レンズによるコルヌアンモニス1および3(CA1、CA3)または歯状回(DG))。
   2. 40倍または63倍の油浸対物レンズに変更して、連続した神経突起と組織化された構造を特定することにより、スライスの解剖学的構造が損なわれていないことを確認してください。MAP2などのニューロンマーカーを基準として使用します(図1A)。
   3. その後、60倍の油浸対物レンズ(開口数[NA] = ~1.3 - 1.4)に切り替え、各チャンネルの設定を調整して最適な信号とコントラストを得てください。高コントラスト/低コントラストオプションを使用して、各レーザーの強度を設定し、ピクセルの飽和を回避します。
      注：これらの設定は使用する顕微鏡によって異なりますが、レーザー出力の設定については、材料の表を参照してください。最適な結果を得るには、1024 x 1024 ピクセルの解像度を使用します。設定は、同じ実験の異なる条件で一定である必要があります。必要に応じて、追加のズームを適用できます。
   4. 染色が均一な深さを評価し、少なくとも8つの等距離(250 nm)平面の画像スタックを取得してください。次に、スライスごとに同じ関心領域から 3 つの隣接する代表的な画像スタックを取得します。
      注：深さはスライスごとに異なる場合がありますが、スライスの表面から常に約2〜5μmであるべきです。
   5. 条件ごとに少なくとも3つのスライスで、治療グループごとに6〜8匹の動物から取得を繰り返します。

表1:免疫蛍光染色に使用されるバッファー。

KH₂PO₄ pH to 7.4

ブロッキング/透過化バッファ	Concentration	Notes
ロバ血清	10%
Triton-X	0.50%
PBS	1x
10x PBS		pH to 7.4
NaCl	1.37 M
KCl	27 mM
NaH2PO4	100 mM
18 mM		4% PFA/4% ショ糖	<
PBS	1x	10xから希釈
PFA	1.33 M
スクロース	117 mM

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Results

表1:免疫蛍光染色に使用されるバッファー。

ブロッキング/透過化バッファー

Materials