1. オルガノタイプスライスの準備
注：このレシピでは、出生後7-9日目(p7-9)に2匹のマウスの子犬を使用し、24個のオルガノタイプスライスを2つの6ウェル培養皿に分割します。特に明記されていない限り、すべての手順は滅菌フードで行い、ニトリルまたはラテックス手袋を使用する必要があります。細胞培養グレードの成分のみを使用してください。
- オートクレーブボトル、解剖ツール（大きなハサミ1個、小さなハサミ1個、大きな平らなヘラ1個、丸みを帯びた鋭い小さなヘラ1個、鉗子1個、詳細は材料リストを参照)、ガラスピペット、ピペットチップ、ティッシュペーパーがスライスの準備に使用されました。
- ガラスピペットの半分は大きな開口部で使用する必要があるため、狭い端を折ってください。
- グラスが狭くなり始めるポイントのすぐ下にあるピペットの周りにダイヤモンドスクライバーペン（利用可能な場合）を使用してスコアを付けます。次に、ピペットの先のとがった端をニトリル手袋などに入れます。ピペットを作業台に押し付けながら折り曲げて、先端を慎重に折ります。
- 次に、壊れた端をサンドペーパーでこすって鈍くするか、ブンゼンバーナーで少し溶かします。壊れたピペットは、切断された脳のスライスを移すために使用され、壊れた端はゴム球に変わり、大きな開放端は溶液/スライスに触れます。
注:これは滅菌フードでは行われず、数日前に行うことができます。
- 文化料理を準備します。
注: これはスライスの前日またはスライスの少なくとも2時間前に行うことができます。- ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜(紙吹雪)を滅菌します。2つの滅菌鉗子を使用して、周囲の青いプラスチック片から1つの紙吹雪を取り除きます。次に、96%エタノール(EtOH)を含むシャーレに2回浸して滅菌します。次に、紙吹雪を滅菌済みの大きなシャーレに平らに置いて乾かします。
注:紙吹雪は、培養インサートの膜に似た親水性PTFE膜です。紙吹雪の使用は、鉗子で紙吹雪を持ち上げることにより、単一のスライスをインサートから顕微鏡のセットアップに簡単に移すことができるため、ライブイメージングを支援します(詳細については4.8.を参照)。あるいは、脳スライスは紙吹雪なしで培養することができます(紙吹雪では、スライスは培養インサートの膜に直接付着します)。この場合、メンブレンインサートをメスで切断して、スライスを顕微鏡浴に移す必要があります。 - 6ウェル培養皿の各ウェルに1mLの培地を加えます。
- 滅菌鉗子を使用して、各ウェルに培養インサートを1つずつ入れます。インサートと培地の間に気泡が入らないようにしてください。
注:お金と環境を節約するために、文化インサートを再利用することが可能です。これは、蒸留水(dH2O)で十分にすすぎ、その後、再利用するまで70% EtOHで最低24時間インキュベートすることで行うことができます。新しい培養の準備をするときは、細胞培養プレートでインサートを紫外線(UV)で15〜30分間乾燥させます。 - 各カルチャーインサートに2つの(滅菌済みおよび乾燥した)紙吹雪を置きます。紙吹雪をインサートの端に向けて配置し、重なりを最小限に抑えます。
- プレートを細胞培養インキュベーターに5%のCO2を入れた37°Cに入れます。
- 二酸化ガス(95%O2/5%CO2)を含む泡冷解剖媒体。溶液を滅菌状態に保つには、ガスボンベからのチューブを滅菌シリンジフィルター(0.22 μmの細孔サイズ)に接続します。
- シリンジフィルターのもう一方の端を滅菌ガラスピペットに接続された滅菌チューブに結合します。ガラスピペットを溶液に入れ、パラフィルムで覆い、ガスをオンにします。解剖液は氷の上に置いてください。
- 解剖/スライスエリアを準備します。
注：理想的には、この手順は滅菌フードで行う必要があります。これが不可能な場合は、ビブラトームを作業台に置いておくことができます。この場合、ヘアネットとフェイスマスクを使用することをお勧めします。- span style='background-color:transparent;color:#000000;'>片刃のカミソリの刃を使用して、長方形のアガロースゲル(約2 cm x 0.5 cm)を切り取り、ビブラトームステージに接着して、長辺がビブラトームブレードに向くようにします。
- すべての表面とビブラート部分を70% EtOHで清掃し、オートクレーブ処理されたティッシュペーパーで拭いてください。
注: 脳組織と接触するすべての部分が完全に乾燥していることが重要です。なぜなら、EtOHは細胞に損傷を与える可能性があるためです。 - 滅菌カミソリの刃をビブラトームに取り付け、ビブラートームがこの機能を持っているかどうかを確認するために振動チェックを行います。
- オートクレーブされた解剖ツール、オートクレーブされたティッシュワイプ、4つの小さなシャーレ、丸いメス、ゴム球付きのガラスピペット2つ、オープンエンドガラスピペット2つ(pt.1.1参照)、瞬間接着剤(EtOHを噴霧)をフードに入れてください。
- 泡立った解剖媒体をビブラートボートと4つの小さなシャーレに注ぎます。
注：このステップは、この時点からの媒体が泡立ったり氷上に保持されたりしないため、解剖の直前にのみ行う必要があります。
- 脳を解剖し、マウントします。
注: 健康なスライスを得るためには、この手順を迅速かつ正確に行う必要があります。ある程度の練習が必要です。- 動物#1を首を脱臼させるか、地元のガイドラインに従って安楽死させ、大きなハサミで首を切ってください。
- 小さくて鋭いハサミを使用して、首から鼻まで矢状切開を行い、それを脇に引っ張って頭蓋骨を露出させることで、皮膚をすばやく取り除きます。
- 矢状縫合糸に沿って切断し、続いて前頭骨の内側部分とランボイド縫合糸(大脳と小脳の境界)を横方向に切開します。
- 鉗子を使用して、両側の頭蓋骨を曲げて開きます。脳の腹側の下に丸みを帯びた鋭いヘラを挿入し、ヘラを横方向にゆっくりと動かすことにより、脳神経を脳から切断します。
- 一刃のカミソリの刃を使用して、小脳に冠状切開吻を作成します。
注:このカットは、スライスがカットされる角度を決定します。したがって、まっすぐな角度で作成する必要があります。 - 脳を頭蓋骨から取り出し、解剖媒体を含む小さなシャーレに入れます。
- 動物#2に対して手順1.6.1 - 1.6.4を繰り返し、この脳を2番目のシャーレに入れてください。
注:動物は無菌ではありません。フードの片側で解剖を行い、頭蓋骨から脳が取り除かれたら、反対側のきれいな側に移動します。 - 手袋を交換してください。
- ビブラートステージに脳を取り付けます:取り付けられたアガロースゲルのすぐ前のステージに瞬間接着剤の薄い層を追加します。大きな平らなヘラで脳#1を保持し、切りたての(尾側)側がヘラに触れ、腹側がアガロースゲルを向いている(そしてできるだけ近づいている)ようにします。
- 次に、脳を鉗子のセットでヘラから押し出して、接着剤の上にそっと置きます。脳#2のために十分なスペースを残してください。
注: 脳がステージにしっかりと付着していることが重要ですが、過度の接着剤はカッティングを妨げる可能性があるためです。
- 脳#1をマウントした直後に、大きなヘラを使って脳の上に解剖媒体を数滴追加してください。これにより、脳が湿った状態を保ち、接着剤が硬化し、脳の側面にくっつくのを防ぐことができます。
- 脳#2に対して手順1.6.7と1.6.8を繰り返します。
- ステージをビブラートボートに取り付けます。
- 厚さ230μmの冠状スライスを、振幅1 - 1.5 mm、周波数85 Hz、速度0.2 mm/sでカットします。吻側から尾側約1.4 mmから尾側2.1 mmのスライスをブレグマまで集めます。
- 各スライスがカットされた後に、オープンエンドのガラスピペットを使用してスライスを収集します（pt.1.1）。スライスを解剖媒体の入ったシャーレに移します。丸みを帯びたメスを使用して、スライスを2つに切り、2つの半球を分割します。
- すべてのスライスがカットされたら、スライスを培養皿に入れてください。
- 培養皿を(一度に一つずつ)インキュベーターから取り出します。
- オープンエンドのガラスピペットを使用して、各紙吹雪に一切れずつ慎重に移します。
注:スライスは紙吹雪の中央に平らに置かれるべきです。これにはある程度のスキルが必要です。ただし、一部のスライスが完璧でない場合は、すべてのスライスをできるだけ早くインキュベーターに入れることが重要であるため、それらを移動しようとして時間を費やすよりも、それらを残す方が良いでしょう。 - ガラスピペット(先のとがった端)を使用して、スライスに触れずに余分な媒体を優しく取り除きます。
注:インキュベーション中にスライスを液体に浸さないでください。したがって、余分な媒体は、スライスが空気にさらされるように吸引する必要があります(媒体の薄膜はまだスライスを覆います)。液体に浸されたままのスライスは、通常、健康に欠けるか、死んでしまいます(4と私たちの観察結果)。 - すべての紙吹雪が一切れになったら、皿をインキュベーターに戻します。
- ディッシュ #2 に対して 1.7.8. - 1.8.4. を繰り返します。
- 文化媒体を変更してください。
注：これはスライスの翌日(in vitroでの1日目、DIV1)に行い、その後は2〜3日ごとに行う必要があります。- 培地をウォーターバスまたはインキュベーターで予熱します。
- 滅菌フード内で、真空吸引または滅菌チップ付きの通常のピペットを使用して、各ウェルから培地を吸引してください。これは、皿をそっと(約30度)傾け、ピペットチップを培養インサートの端に置くことによって行われます。
- 各ウェルから約800μLを取り除きます（インサートの底を培地で覆うのに十分な培地を残します）。次に、清潔なピペットを使用して、予熱した培地800μLを各ウェルに加えます。次に、皿を細胞培養インキュベーターに戻します。
2. ウイルス導入
- 目的のプラスミドを持つアデノ随伴ウイルス(AAV)を購入または作成してください。
注：このプロトコルは、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター12（AAV2/8 MBP_mito_dsredまたはAAV2/8 MBP_mito_GFP)の転写制御下で、ミトコンドリア標的dsredまたはGFPを保有するAAV血清型2/8）(AAV 2/8)の使用を説明しています。これは、オリゴデンドロサイトミトコンドリアを可視化するためのものです。一般的なCAGプロモーター(AAV 2/8 CAG_GFPまたはAAV 2/8 CAG_tdtomato)によって駆動されるレポーター遺伝子としてGFPまたはtdtotoを運ぶAAV 2/8を使用して、オリゴデンドロサイトの細胞質を視覚化します。したがって、AAV2/8 MBP_mito_dsredとAAV 2/8 CAG_GFPの組み合わせにより、オリゴデンドロサイトに赤色のミトコンドリアと緑色の細胞質が得られ、AAV2/8 MBP_mito_GFPとCAG_tdtomatoのAAV2/8を組み合わせると、緑色のミトコンドリアと赤色の細胞質が得られます。構成体については、他の場所でより詳細に説明されています13。 - 7日目のin vitro(DIV7)で、AAVを持つオリゴデンドロサイトが形質導入されます。
注意：AAVを使用する際は、安全規制に従ってください。適切なトレーニングを受け、必要なバイオセーフティレベルの承認を受けていることを確認してください。以下のすべての点は、手袋と白衣を使用してクラスIIバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。ここでは、スライスの皮質領域へのAAVの適用について説明しますが、これは最良の回復を示す領域です。- 予熱した(37°C)培地でAAVを希釈します。約2×109ゲノムコピー/mL(GC/mL)の希釈が推奨され、スライス内の単一細胞のイメージングを可能にするオリゴデンドロサイトのスパースな形質導入が得られます。ただし、特定の実験に適した形質導入オリゴデンドロサイトの密度を確保するために、異なる力価を使用したパイロットを実施する必要があります。2つの異なるAAVを使用する場合は、それらを同じ溶液で混合し、同時にスライスに追加する必要があります。
- 各スライスに約1.3μLの希釈AAVを追加してください。ピペットチップの外側が乾いていることを確認してください。1.3μLで希釈したAAVをピペットし、ピペットチップ(約1mm離れて)でスライスに触れないように、ピペットを皮質の上でできるだけ近くに保持します。
- 次に、ゆっくりと溶液をピペットから押し出します。溶液がスライスに触れたら、ピペットの先端を皮質の上に移動させて、溶液を皮質領域全体に広げます。
注: この手順は、スライスが必要以上に長くフードから出ないように、できるだけ早く行う必要があります。これを一度に1つの皿で行い、最初の皿をインキュベーターに戻してから、皿#2に取り掛かります。組織に損傷を与えることなくAAVを満足のいく分布にするには、ある程度の練習と安定した手が必要です。
- 細胞実験室で直立蛍光顕微鏡が利用可能な場合、培養中にディッシュを顕微鏡下に置くことでタンパク質の発現を確認することができます。
注:ディッシュは2〜5分以上インキュベーターから出さないでください。
3. タイムラプスイメージング
注:イメージングは、蛍光マーカーの発現レベルが十分で、スライスが健康に見えるときはいつでも実行できます（通常はDIV11-14）。
- 泡立ったイメージング溶液が加熱され、浴槽に出入りできるように、顕微鏡、灌流、および加熱が正しく設定されていることを確認してください。
注:浴槽にはさまざまな解決策があります。ここでは、簡単なバージョンを示します。- ブルータック/ファンタックで浴槽の側面に取り付けられた鈍い注射針（~45°で曲げて、浴槽のインとアウトレットを作ります。
- チューブが連続的に泡立ったイメージング溶液のボトルから蠕動ポンプを経由し、ヒーターユニットの加熱管を通って、浴槽のインレットシリンジ針に通ることを確認してください。
- 別のチューブを注射針の出口に接続してください。その後、このチューブは蠕動ポンプを経由して、イメージング溶液のボトル(または廃液ボトル)に戻ります。
- 二酸化水素ガスを含むバブルイメージング溶液。
注:これはイメージングの少なくとも15分前に開始し、実験全体を通して継続する必要があります。 - 蠕動ポンプとヒーターをオンにし、溶液を浴に通して最適な浴温度(37 ± 0.5 °C)を得てください。温度ユニットに接続されている温度計センサーが浴液に浸されていることを確認してください。
- 顕微鏡、蛍光ランプ、適切なレーザーをオンにしてください。
- サンプルに適した光路を設定してください。
注:これは顕微鏡のセットアップとプローブによって異なります。共焦点顕微鏡の使用方法に関する一般的な知識が必要であり、ここでは扱いません。 - 適切な倍率と開口数(n.a.)の水浸対物レンズを使用してください。40倍水浸型プランアポクロマート対物レンズ(n.a.1.0)を使用しています。
- タイムラプスビデオの光学部分を約2 - 2.5 μmにするためにピンホールを開きます。これにより、タイムラプス中にミトコンドリアが焦点から外れる可能性が低くなります。
- 器官型スライスを浴槽に移す：<ol style='list-style-type:decimal;'>
- 小さなプラスチックのペトリ皿にイメージング溶液または培養液を一滴加えます。
- 滅菌フード内で、滅菌鉗子を使用して、膜インサートから液滴に1つの器官型スライスを移します。鉗子は紙吹雪にのみ触れ、スライスには触れないようにする必要があります。
- シャーレに蓋をします。
- すぐに残りのスライスを含む培養皿をインキュベーターに戻してください。
- スライスが入ったシャーレを顕微鏡に持ってきてください。
- スライスを顕微鏡浴に移す間、蠕動ポンプをオフにしてください。まず、鉗子を使用して、ペトリ皿からスライスした紙吹雪をお風呂の上部に持ち上げます(紙吹雪が浮きます)。次に、鉗子の2つの先端を紙吹雪の両側に置き、スライスに触れずに紙吹雪に触れるようにし、紙吹雪を溶液を通して浴槽の底に押し込みます。紙吹雪をお風呂の中央の中央に置きます。
- 鉗子を使用して、スライスに触れずに紙吹雪の上に固定アンカー(ハープ)を配置します。
注:ハープは馬蹄形のプラチナアンカーで、スライスが水浴中に浮いたり漂ったりするのを防ぐために使用されます。アキュートスライスの場合、細い弦がハープの片側から反対側に走ります(音楽のハープに似ています)。有機型スライスの場合、ハープは弦を使わず、スライスに触れることなく紙吹雪の上に置けるように紙吹雪のサイズに合う必要があります。 - 蠕動ポンプを再びオンにします。
対物レンズをサンプルまで下げてください。画像化するセルと領域を選択します。
注：レーザー光線への過度の曝露は細胞毒性を引き起こす可能性があるため、避けてください（以下のポイントのヒントを参照)。- <>span style='background-color:transparent;color:#000000;'>接眼レンズと蛍光灯を使用して、正しい表情で健康そうなオリゴデンドロサイトを見つけてください。通常、蛍光タンパク質の過剰発現が強いオリゴデンドロサイトは不健康に見えます。不健康なオリゴデンドロサイトは、塊状の外観のプロセスを持ち、ミトコンドリアは断片化されて見えます。健康なオリゴデンドロサイトでは、体細胞と突起は滑らかに見え、ミトコンドリアの長さはさまざまです(ただし、通常はニューロンや星状細胞よりもはるかに短いです)。
- 関心のあるセルを視野の中央に配置します。
- ソフトウェア(ライカおよびツァイス顕微鏡用)の「ライブ」機能を使用して、画面上の細胞を特定し、関心のある領域、例えば、いくつかの主要なプロセスまたはミエリン鞘を含む細胞の一部、または単一のプロセスまたはミエリン鞘を選択します。
注：できるだけ多くのプロセス/シースを画像化できるようにするには、x-y方向に比較的平坦なプロセスを含む領域を選択してください。 - 関心のあるフィールドを拡大します（通常、ピクセルサイズが0.14 - 0.30 μmの画像を生成します)。
- 「領域」ツールを使用して、領域の周囲に長方形を描き、選択した領域のみをスキャンするオプションを選択してください。スキャン時間、つまりレーザー露光は、選択した領域をスキャンするだけで短縮されます。
注: 水平方向の長方形の領域は、スキャンされる線の数が少ないため、垂直方向の領域よりも速くスキャンされます。縦方向の長方形領域をスキャンする場合、スキャンフィールドを90度回転させることでスキャン時間を短縮できます(回転ツールを使用)。
レーザーの出力とゲインを調整して、ミトコンドリアがよく見えるようにします。
注: 必要最小限のレーザー出力を使用してください。可能であれば、レーザー出力を上げるのではなく、ゲインを上げてください。細胞毒性を引き起こすだけでなく、レーザー出力が高すぎると、時間の経過とともに画像化されたオブジェクトが漂白するため、スキャン中のレーザー出力またはゲインをさらに増加させる必要があります。必要なレーザー出力とゲインは、発現レベルと顕微鏡によって異なります。LSM700共焦点顕微鏡では、20〜40μWの出力で555nmレーザーを使用してdsredまたはtdtotoを画像化し、488nmレーザーを20〜30μWで使用してGFP(対物レンズの背面絞りで測定されたレーザー出力)を画像化します。ライブイメージングではゲインが高に設定され、通常はGFPが700〜800、dsredとtdtotoが850〜980の範囲です。ゲインが高いと、バックグラウンドノイズが増える可能性がありますが、デジタルオフセットを増やすことで除去されます(オフセット値は通常0〜15の間にあります)。私たちの経験では、MBP_mito_GFPを使用すると、MBP_mito_dsredよりも優れた信号対雑音比が得られます。スキャン速度を選択します。
注: 高速スキャン速度を使用し、小さなスキャン領域を描画することで、スキャン時間を最小限に抑えてください（以下のポイント4.10.5を参照)。また、双方向スキャンを実行することでスキャン時間を節約することも可能です。ただし、画質が悪いため、これはお勧めしません。タイムラプス録画の頻度と期間を設定します。例えば、オリゴデンドロサイトのミトコンドリアイメージングのために、2秒ごとに合計20分間画像をキャプチャします。
注:頻度と期間は、関心のあるオブジェクトの移動性に応じて設定する必要があります。周波数が高いほど、標本はより多くのレーザー光にさらされますが、動きの速い物体は、タイムラプスビデオの合計時間も短くする必要があります(例えば、ニューロンのミトコンドリアは、オリゴデンドロサイトのミトコンドリアよりも頻繁に、はるかに高速で移動し、通常、毎秒合計2分間画像化されます16)。タイムラプス録画を開始します。
注:ミトコンドリアは、記録中に焦点が合わなくなったり、画像領域から外れたりすることがあります。振動や動きを最小限に抑えるために、バスの内と出口を調整し、必要に応じてポンプ速度を下げます。通常、ピントの小さな変化はまだ発生します。したがって、イメージング中の画面の継続的な監視が必要であり、記録中の焦点をわずかに調整する必要があります。セル全体のzスタックをキャプチャして、セルと画像化されたプロセスを将来識別します。
注:より良い解像度を得るには、ピンホールをzスタックの1エアリーユニットにリセットする必要があります。