マウス脳スライス中の化合物に対するミクログリアプロセス引力を研究するための2光子顕微鏡

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査および承認されています。

1.二光子顕微鏡

1. Parameters setting
   1. 多光子システム（ハイブリッド検出器、レーザー、スキャナー、電気光学変調器、顕微鏡)のスイッチを入れてください。
   2. レーザーを920nmに調整し、レーザーがモードロックされていることを確認し、出力を5%〜15%、ゲインを10%に設定します。これは、対物レンズの下で3〜5mWの電力に相当します。デスキャンされていない検出器が噛み合っていること、および適切な発光フィルターと励起フィルターが取り付けられていることを確認します。
   3. イメージングソフトウェアのパラメータを次の値に設定します:フレームサイズの場合、295.07 x 295.07μmの領域に対応する1024 x 1024ピクセル。ズームの場合、2。信号のノイズが非常に多い場合は、ライン平均を 2 に適用します。ピクセルダイナミクスについては、イメージングソフトウェアを12ビット以上に設定してください。
      NOTE: 高いビット値を持つ画像は、研究者が低いビット値を持つ画像よりも蛍光強度の小さな違いを区別することを可能にします:8ビット画像の1つのグレー値の変化は、12ビット画像の16グレー値と16ビット画像内の256グレー値の変化に対応します。したがって、高ビット画像は定量分析に適していますが、ビット深度とともにサイズが大きくなると、ストレージ容量と計算能力が制限される可能性があります。
   4. Zインターバル範囲が2μm、Tインターバルが2分であるスキャンモードXYZTを選択します。
      NOTE: X、Y、Z の分解能は、ナイキスト サンプリング定理によって決定されます。ミクログリアプロセス(直径<1 μm)の分解能には、約0.8のZステップサイズが最適ですが、多光子顕微鏡の光学分解能には限界があります(920 nm、0.95 NAの対物レンズで、軸方向の分解能は約1 μmです)。その物理的な障壁に加えて、ライブイメージング実験では、感度または信号対雑音比、解像度、速度、および総観察時間が重要です。これらすべてのパラメータを考慮して、ここでは 2 μm の z-step、1024 x 1024 ピクセルの画像サイズ、HyD 検出器と組み合わせた共振スキャナーを使用した高速取得 (50 個の z-プランを取得するのに約 15 秒かかります) を選択しました。集録の頻度は2分ごとに1つのXYZTシリーズで、合計時間は30分です。セットアップが十分に速くない、または感度が十分でない場合は、横方向の解像度(512 x 512まで)またはzスライスの数を減らすことができます（最も強い蛍光を示すz深度のみでイメージングすることにより[つまり、蛍光がかすかな最も深いzスライスではありません])、またはスキャナーの速度を低下させます。軸方向の分解能は、zステップを3μmまで増やすことでも低下させることができますが、これは定量に影響を与える可能性があるため、比較するすべての実験を同じzステップで実行する必要があります。
      注: ミクログリアのみの遺伝子欠失を誘導するために使用され、ミクログリアが黄色蛍光タンパク質(YFP)を構成的に発現するマウス系統であるCX3CR1creER-YFPマウスのスライスでも同様の実験を行うことが可能です。しかし、YFPの発現レベルはCX3CRの緑色蛍光タンパク質(GFP)と比較して非常に低いです^GFP/+匹のマウス;したがって、イメージングは可能ですが、困難であり、取得パラメータの最適化が必要です。以下のように調整することをお勧めします。
   5. レーザーを970nm(920nmよりもYFP励起により適している)、出力を50%、ゲインを50%に調整します。これは、5〜6mWの目標値でのレーザー出力に相当します。
   6. ライン平均を4(またはそれ以上)に設定して、信号対雑音比を改善します。
2. スライスとガラスマイクロピペットの位置、およびコンパウンドのローカルアプリケーション
   1. 録音開始の30分前に、蠕動ポンプを録音チャンバーに接続してください。50 mLの超純水で全灌流システムを洗浄した後、ガラスビーカーに含まれるaCSF(50 mL)を一定のカーボゲン化下で記録チャンバーの灌流を開始します。実験全体を通して、インラインマイクロヒーターまたはペルチェヒーターを使用して、循環するaCSFを32°Cに保ちます。
      NOTE: 上部と下部の灌流を備えた特定の灌流チャンバーは、スライスの両側の酸素化を最適化するように設計されています。灌流チャンバーは、完全にフィットする2つの部分で構成されており、その間にポリアミドメッシュが張られています（Figure 1A,B).スライスがガラスカバースリップに直接置かれている他のタイプのチャンバーと比較して、このチャンバーはスライスの底部でのニューロン死を減らし、生存率を向上させ、その腫れによって引き起こされるスライスの動きを減らします。
   2. 広口ディスポーザブルトランスファーピペットで、撮像する脳切片をaCSFビーカーに移してレンズペーパーを取り出し、沈め(気泡が付着していない証明として)、記録室(灌流)室に移します。
   3. スライスホルダー(プラチナ製のヘアピンで、2本の枝を平行なナイロン糸で結合したもの)をスライス上に配置し、灌流によるスライスの動きを最小限に抑えます。
   4. 低倍率対物レンズ(5倍または10倍)で、脳の関心領域(露光時間:50〜80ミリ秒)を明視野照明で狙います。高倍率(25倍、レンズ0.35倍)の水浸対物レンズに切り替えて、位置を調整します。
      NOTE: スライスホルダーのナイロン糸に近いフィールドを画像化すると、光が遮られ、スライスが局所的に変形する可能性があるため、避けてください。対象エリアがフラットであることを確認します。必要に応じて、スライスホルダーを取り外して、スライスやスライスホルダーの位置を変更します。
   5. 蛍光照明を使用して、野外でイメージングする蛍光ミクログリア細胞を見つけます(露光時間:250〜500ミリ秒)。
      注: このステップにより、研究者は関心領域内の細胞の存在とその蛍光強度を確認し、細胞破片の量を制御することができます。
   6. ピペットにATP、5-HT、または最終濃度で目的の薬物を含む10 μLのaCSFを埋め戻します。先端を下に向けて、薬剤を充填したピペットを静かに振って、先端に閉じ込められた気泡を取り除きます。
      注: 注入する溶液が気泡を形成する傾向がある場合は、内部フィラメントを備えたホウケイ酸ピペットの使用を検討してください。ピペットからのATPの漏れは、注入前であってもミクログリアプロセスを引き付ける可能性があります(これが発生した場合、分析ステップで明らかになります)。これは、使用するATP濃度(500 μmol·L^-1)、問題がある場合は、ステップ1.2.6でATP(または他の化合物)溶液を添加する前に、マイクロピペットに2mLのaCSFを事前に充填することを検討してください。
   7. 充填されたピペットをピペットホルダーに取り付け、透明なチューブで5mLシリンジに接続し、プランジャーを5mLの位置に配置します。ピペットホルダー自体は、3軸マイクロマニピュレーターに取り付けられています。
   8. 明視野照明下で、マイクロマニピュレーターを使用してピペットをフィールドの中央に配置します。再現性のある最適なセンタリングを実現するには、画像に定規を表示して使用します。
   9. ピペットをスライスに向かってゆっくりと下げ、ピペットの先端がスライスの表面に軽く触れるまで、対物レンズを同時に制御および調整します。スライスが触れられたことが見えるようになったらすぐにピペットの下降を停止すると、ピペットの先端がスライスの表面の80〜100μmを貫通することができます（<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'図2Bを参照)。).
   10. レーザーを調整し(上記のパラメータを参照)、顕微鏡を多光子モードに切り替えます。チャンバーが任意の光源(コンピューター画面など)から遮蔽されていることを確認してください。非デスキャン検出器のスイッチをオンにし、ゲインを設定します。色分けされた上限を持つルックアップテーブル(LUT)を使用して、画像内のピクセルが飽和しないようにします。
   11. 画像化するスライスの厚さを決定します(つまり、蛍光が検出可能な上部と下部のz位置[通常は合計220〜290μm])。
       注: スライスの表面では、突起の密度が高く、おそらくミクログリアの密度が高く、スライスの内部と比較して、しばしば異常な形態をしています。この蓄積は時間とともにより顕著になります（つまり.、最初に画像化される脳のスライスよりも最後の方が見やすくなります)。したがって、最初の~30 μmのz面は分析に使用せず、取得のためにスキップすることもできます。
   12. 合計30分(または必要に応じてそれ以上)の記録を開始し、5分間のベースラインの後、テストする化合物を局所に適用します(イメージングを中断せずに)。これを行うには、マイクロピペットに接続されたシリンジのプランジャーを5mLから1mLの位置まで(約5秒で)ゆっくりと押します。プランジャーを押すときの抵抗はすぐに感じなければなりません。そうでない場合は、先端が折れている可能性があります。
       NOTE: 訓練を受けた実験者にとって、この方法による注入は再現性がありますが、シリンジを手動で操作する代わりに、ピペットを自動圧力排出システムにリンクして、供給される量をより適切に制御することができます。注入により、注入部位でスライスに物理的な歪みが生じます。この歪みは、注射後の最初の2つまたは3つの画像では後方に見えますが、4番目の画像(つまり、注射の8分後)では見えません。それが続く場合は、ピペット調製のパラメーターを変更することを検討してください。
   13. 取得の終了時(30分)に、マイクロピペットを廃棄し、スライスを取り出します。
   14. 新しいスライスのイメージングを開始する前に、2Dムービー(セクション2.1)を作成して、ミクログリアが正常な形態を持ち、動いていること、したがってスライスが健康であることを確認してください。

2.ミクログリアプロセスの魅力の分析

1. 2D投影とドリフトの補正
   1. ファイル（.LIF)とフィジー。
   2. 必要であれば、サブスタックを作成してください（Image/Stacks/Tools/Make Substack) 対象の z 平面のみを使用します。たとえば、スライスの表面に対応するz面が取得されているが、解析に使用されない場合は除外します(手順1.2.11の後の注を参照)と、蛍光のない最も深いz面を除外します。最終スタックには、通常、90〜110個のzスライス(180〜220μm)が含まれています。
   3. Z project 関数 (Image/Stacks/Z Project") を選択し、 Max Intensity Zスタックの投影を毎回取得するための投影タイプ点。
   4. MultiStackRegプラグイン (Plugin/Registration/MultiStackReg)、選択 アクション1： Align とTransformation：剛体、取得中に発生した可能性のあるわずかなドリフトを修正します。この 2D ムービーを新しいファイルとして保存します (.tiff)。
2. データ処理
   1. この新しいファイルをIcyで開いてください。
   2. 円形を描きます R1、注入部位を中心とする直径 35 μm の関心領域 (ROI) です (特にピペットの影と注入時に生じる歪みによって識別されます)。
   3. プラグイン<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>ROI intensity evolutionR1の時間。
   4. 結果を.XLSファイルに保存します。
3. 結果の定量化と表現
   1. ミクログリアの応答を経時的に定量化するには、各時点で決定してください。
      その後、結果はミクログリア応答の動力学として、または特定の時点で表現することができます（ Figure 3).

図1:インターフェースチャンバーの詳細。 (A) スライスホルダーの3Dプリントのアウトライン。ホルダーの外径は7cmです(B)ナイロンメッシュ(矢印)を備えたインターフェーススライスホルダーにより、研究者は液体と空気の界面でスライスを保持できます。(C)スライスをカルボジェンテッド(矢印はバブリング用のチューブ)と加湿環境で画像化する前に維持することを可能にするインターフェースチャンバーデバイス。

図2:灌流チャンバーの詳細。 (A) 3Dプリントのアウトライン。灌流チャンバーの外径は5.9cm(B)スライスを支えるナイロンメッシュ(矢印)を備えた灌流チャンバーは、スライスが下のスライドに触れるのを防ぎ、aCSFがその上下を流れるようにします。(C)2光子顕微鏡での組み立ての写真。化合物を局所的に送達するマイクロピペットが右側(アスタリスク)に見えます。(D)明視野で撮影されたピペット。スケールバー = 60 μm.

図3:スライス内のマイクロピペットの位置 フルオレセイン(1 μM)を充填したマイクロピペットで(30日齢の動物の海馬で)画像のスタックを取得した例。フルオレセインは、z軸(A)またはy軸(B)に沿った最大投影でピペット(アスタリスク)を配置することを可能にします。パネルBでは、蛍光は弱いですが、ピペットチップの下にはミクログリアもあることに注意してください。この図の例では、スライスの最も表面的な部分で撮影された画像を含むフルスタックが投影に使用されています。パネルAのスケールバー= 30 μm、パネルBの示された通り(各目盛り= 50 μm)。スタックのz厚さ = 220 μm.

図4:最適でない実験の例。 これらのスライスは、画像化する前に 6 時間以上待ち、上面から画像化されています。(A)多くの破片 (ほぼ丸い蛍光粒子ですが、不規則な境界線、アスタリスク) と "ふさふさした" ミクログリア (矢印) を含む、つまり、多数の短いプロセスを持つ z スタックの例。軸索成長円錐のように見える拡大されたプロセス端子(矢印)に注意してください。スタックのz厚さ= 220μm。他の 2 つのパネルは、同じスライスの 2 つのサブスタックを示しており、(B) 1-30 の z-平面 (z-thickness = 59 μm) と (C) 30-120 の z-planes (z-thickness = 180 μm) があります。上面(パネルBに表示)には、パネルAのような大きなプロセス端子や破片に加えて、珍しい大きな平らな体や突起(星)を持つミクログリアがあります。より深い平面(パネルCに表示)には、破片や平らな物体はありませんが、セルはふさふさしており(矢印)、密度は異常に高くなっています。全体として、これらの観察は、ミクログリアが正常な状態にないことを示しています。