Golgi-Cox金属染色法によるマウス脳切片におけるニューロンの顕微鏡イメージング

要約

出典:Louth, E. L., et al.Golgi-Cox法を使用して、厚い脳セクション内のニューロンをイメージングします。J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、ゴルジコックス染色された厚い脳切片のニューロンを、上下の焦点境界を設定し、重なり合う画像をキャプチャすることでイメージングする方法を示しています。詳細なニューロンの投影を確保するために複数の位置が画像化され、それらを組み合わせて3D表現が作成されます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. ゴルジ・コックス染色

1. ゴルジ・コックス脳の含浸
   1. {}}重クロム酸カリウム1%(w/v)、クロム酸カリウム0.8%(w/v)、塩化水銀1%(w/v)のゴルジ・コックス溶液を、重クロム酸カリウムとクロム酸カリウムを別々に高品質の水に溶かして作製します。溶液を混合し、塩化水銀を加え、グレード1の濾紙を使用して最終溶液をろ過します。溶液は最大1か月間暗闇で保管してください。
   2. 5%イソフルランを使用してマウスを麻酔します。
   3. ネズミを斬首して安楽死させ、脳をすばやく取り除きます。
   4. 17 mL の Golgi-Cox 溶液を含む 20 mL ガラス製シンチレーションバイアルに脳を入れ、室温で 25 日間暗所でインキュベートします。
   5. 40 mL のスクロース凍結保護剤 (0.1 M リン酸緩衝液中の 30% (w/v) スクロース) を含む 50 mL の円錐形チューブに脳を低温保護します。 pH 7.4) を暗所で 4 °C で 24 時間
      注: 次のオプションの 3 つのステップは、この段階で脳を長期保存するために、メイン プロトコルの代替として採用できます。
   6. ドライアイスで予冷した200mLのイソペンタンに脳全体を浸して凍結します。
   7. 凍結した脳を50mLの円錐形チューブに入れ、-80°Cの暗所で保存します。
   8. 進行する準備ができたら、40mLのスクロース凍結保護剤が入った50mLの円錐形チューブに入れ、4°Cの暗所で24時間保持して脳を解凍します。
2. 脳切片
   1. ショ糖から脳を取り出し、カミソリの刃で小脳を切り取り、脳の残りの尾側端に平らな縁を残すことで、脳を切片化のためにブロックします。
   2. 寒天(水で3%(w / v))を溶けるまで加熱し、融点をわずかに超えるまで冷まします。
   3. 脳を尾側の端を下にして小さな使い捨ての計量皿に入れ、それを覆うのに十分な量の溶かした寒天を追加します。
   4. 寒天が固まったら、余分な寒天を切り取り、脳の周囲に約2〜4 mmを残し、少量のエチルシアノアクリレート接着剤を使用して、尾側の端を下にして脳をビブラトームのステージに接着します。
   5. ビブラトームのステージ領域に脳を覆うのに十分な量のスクロース凍結保護剤を充填し、86 Hz の振動周波数と 0.125 mm/s のブレード前進速度を使用して、400 - 500 μm のスライス厚さ (検査する脳領域によって異なります) で脳を切片にします。
   6. 小さなペイントブラシを使用して、 市販のメッシュボトムインサートを含み、0.1 Mリン酸緩衝液、pH 7.4に10 mLの6%(W / V)スクロースを事前に充填した6ウェル組織培養プレートのウェルに脳切片を配置します。
   7. 暗所 4 °C O/N で切片をインキュベートします。
3. 脳切片の発達中
   1. 00 0.1 M リン酸緩衝液中の 2% (w/v) パラホルムアルデヒド (PBD) 5 mL を含む新しいウェルに脳切片を移します。 pH 7.4、メッシュボトムインサートを使用。ロッカーでインキュベートし、室温で暗闇の中をゆっくりと移動して15分間します。
   2. 切片は、5 mLの水が入った新しいウェルに移して2回洗浄する必要があります。それらは、室温で暗闇の中で適度な速度で移動するロッカーで5分間洗浄する必要があります.
   3. 2.7%(v/v)水酸化アンモニウム5mLを含む新しいウェルに切片を移します。ロッカーでインキュベートし、室温で暗闇の中をゆっくりと移動して15分間します。
   4. 切片は、5 mLの水が入った新しいウェルに移して2回洗浄する必要があります。それらは、室温で5分間、暗闇の中を適度な速度で移動するロッカーで洗浄する必要があります。
   5. は、最初に購入した濃度の10倍に希釈した5 mLの固定剤Aを含む新しいウェルに切片を移します。ロッカーでインキュベートし、室温で暗闇の中をゆっくりと移動させ、25分間します。
   6. 切片は、5 mLの水が入った新しいウェルに移して2回洗浄する必要があります。暗闇の中、適度な速度で動くロッカーでRTで5分間洗浄します。
4. 脳切片の取り付け
   1. 小さな絵筆を使って、切片を顕微鏡のスライドに取り付けます。ピンセットと小さなティッシュを使用して、余分な水分と寒天を取り除きます。脱水を進める前に、すべての寒天が除去されていることを確認してください。
   2. 切片をRTで約45分間(400μm切片)または90分間(500μm切片)風乾させます。
      注: 乾燥のタイミングと適切なレベルは重要であり、周囲の温度と湿度に応じて各実験室で決定する必要があるかもしれません。乾燥時間が短すぎると、その後の脱水ステップでスライドから部分が脱落し、乾燥時間が長すぎるとセクションに亀裂が入ります。セクションは、適切な乾燥レベルではまだ光沢があるように見えます。
   3. 示されているようにスライドをCoplin染色ジャーに入れることにより、クレシルバイオレットで切片を染色します。
      注: このオプションのステップは、ニューロン核をクレシルバイオレットで染色するために凍結したことのない切片に使用することができます。クレシルバイオレットでインキュベートする前に切片を透明化して再水和すると、切片間で均一に染色され、バックグラウンドが低くなることがわかりました。
      1. 清算剤に5分間入れ、1回繰り返します。
      2. 100%エタノールに5分間入れ、1回繰り返します。
      3. 95%のエタノールを水に入れ、次に75%のエタノールを水に入れ、次に50%のエタノールを水にそれぞれ2分間入れます。
      4. 水に5分間浸す
      5. クレシルバイオレット0.5%(w/v)に7分間入れます。
      6. 水中に2分間入れます。
   4. 示されているように、スライドをCoplin染色ジャーに入れて切片を脱水します。
      1. 50%エタノールを水に入れ、次に75%エタノールを水に入れ、次に95%エタノールを水にそれぞれ2分間入れます。
      2. 100%エタノールに5分間入れ、1回繰り返します。
      3. 清算剤に5分間入れ、1回繰り返します。
         注:これらの脱水とクリアの時間は、この原稿で説明されているようにマウスの脳を処理するのに十分です。ただし、ラットやカウバードなどの他の種の場合、最終的なクリアリングステップを合計で最大15分延長する必要がある場合があることが観察されています。
   5. 無水封入剤を使用したカバースリップセクション。
   6. スライドをRTで暗闇の中で水平に少なくとも5日間乾燥させます.

2。厚い脳切片内の染色されたニューロンのイメージング

1. 画像スタックのキャプチャ
   1. 顕微鏡の電球、カメラ、ステージコントローラーの電源を入れます。
   2. 顕微鏡ソフトウェア(、例:、Neurolucida)を開きます。
   3. 顕微鏡ステージにスライドを置きます。
   4. 1.25X 0.4 N.A. PlanAPO や 4X 0.16 N.A.
      1. などの低倍率対物レンズを使用して、脳部分の 2D ワイドビュー画像を撮影し、画像に焦点を合わせ、露光時間やホワイトバランスなどのカメラ設定を調整します。
      2. 画像取得ウィンドウ内で「単一の画像を取得」を選択して、
      3. セクション上の任意の場所を左クリックして画像をキャプチャして、参照ポイントを作成します。
   5. 10X 0.3 N.A. UPlan FL N対物レンズを使用して、目的のニューロンを含む領域の中解像度の画像スタックをキャプチャします。
      1. 画像に焦点を合わせ、露出やホワイトバランスなどのカメラ設定を調整します。
      2. 画像スタックの上限と下限を設定するには、セクションの上部にフォーカスして、画像取得ウィンドウ内の「スタックの最上位」の横にある「設定」を選択し、次にセクションの下部にフォーカスして、画像取得ウィンドウ内の「スタックの下部」の横にある「設定」を選択します。
      3. 画像取得ウィンドウ内の「画像間の距離」の横に「5μm」と入力して、ステップ距離を5μmに設定します。
      4. 画像取得ウィンドウ内で「画像スタックを取得」を選択して、画像スタックをキャプチャします。
      5. 上記の手順を繰り返して、関心のある領域全体をキャプチャし、すべての画像スタックがX軸とY軸で少なくとも10%重なることを確認します。
   6. 30X 1.05 N.A. シリコーンオイル浸対物レンズを使用して、目的のニューロンを含む領域の高解像度画像スタックをキャプチャします。
      1. スライドに3〜4滴のシリコン浸漬オイルを塗布し、対物レンズをスライドの上に置き、対物レンズとオイルが接触するようにします。
      2. 画像に焦点を合わせ、露出やホワイトバランスなどのカメラ設定を調整します。
      3. 画像スタックの上限と下限を設定するには、セクションの上部にフォーカスして、画像取得ウィンドウ内の「スタックの最上位」の横にある「設定」を選択し、次にセクションの下部にフォーカスして、画像取得ウィンドウ内の「スタックの下部」の横にある「設定」を選択します。
      4. 画像取得ウィンドウ内の「画像間の距離」の横に「1μm」を入力して、ステップ距離を1μmに設定します。
      5. 画像取得ウィンドウ内で「画像スタックを取得」を選択して、画像スタックをキャプチャします。
      6. 上記の手順を繰り返して、関心のある領域全体をキャプチャし、すべての画像スタックがX軸とY軸で少なくとも10%重なることを確認します。
   7. データファイルとすべての画像ファイルを外部処理用にTIFF形式で保存します。
2. Zプロジェクション画像とイメージモンタージュの作成
   1. ImageJでZプロジェクション画像を作成する
      1. Bio-FormatsプラグインがインストールされているImageJソフトウェアを開きます。
      2. 「Plugins」>「Bio-Formats」>「Bio-Formats Importer」を選択します。
      3. 開くイメージスタックファイルを選択します。
      4. ファイルを開いたら、「画像」->「タイプ」->「RGBカラー」を選択して、形式をRGBに変更します。
      5. 「画像」->「スタック」->「Zプロジェクト...」を選択してZ投影を作成します。
      6. 2次元のZ投影画像をTIFFファイルとして保存します。
   2. 対象領域全体の 2 次元イメージ モンタージュを作成します。
      1. ソフトウェア(、、Adobe Photoshopなど)を開きます。
      2. 「ファイル」->「自動化」->「Photomerge」を選択します。
      3. 「参照」を選択し、マージするすべての画像ファイルを追加します。
      4. 「Blend Images」が選択されていることを確認し、「OK」を選択します。
      5. 結果として得られる関心領域全体のモンタージュ画像を TIFF ファイルとして保存します。

材料