マウス脳切片における海馬ニューロン活性化のイメージング

要約

出典:Provenzano, G., et al. Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity after Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders.J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、海馬のニューロンの活性化を視覚化するための免疫組織化学イメージングを示しています。染色された脳切片は、明視野顕微鏡下でより暗い領域を明らかにし、活性化されたニューロンを示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 免疫組織化学

1. 各マウスの3-5の背側海馬切片を、各ウェルに500μlの0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む24枚のマルチウェルプレートに移します。
2. 各ウェルに含まれる切片を500μlの0.1 M PBSで洗浄します（5分間、穏やかに振って3回）。
3. 1%過酸化水素（H₂O₂）の切片をPBSで20分間穏やかに攪拌しながらインキュベートすることにより、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチします。
4. 0.1 M PBSでセクションを穏やかに攪拌しながら洗浄します（3 x 5分]。
5. 組織の透過化:PBSで0.2%Triton X-100で切片を5分間インキュベートします。
6. 上記のステップ（1.4）1.5）の間に、実験全体（セクション数×100μl×3ステップ）に十分なブロッキングバッファー）10%のヤギ血清と0.1%のTriton-X100）を作成してください）。
7. 注：二次抗体（Ab）(ビオチンに結合)が作られたのと同じ種の血清を使用してください。
8. ブロッキングバッファー(100 μl/切片)中の切片を室温(RT)で1時間インキュベートし、穏やかに攪拌することで、抗体の非特異的結合を防ぎます。
9. ブロッキングバッファーで希釈した一次Abリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ(pERK)の切片を、穏やかに攪拌しながら4°Cで一晩インキュベートします。
10. 0.1 M PBSでセクションを穏やかに攪拌しながら洗浄します（3 x 5分]。
11. ビオチン(1:250)で希釈した二次抗体をブロッキングバッファー(ステップ1.6で使用したものと同じ)で希釈し、室温で穏やかに攪拌しながら1時間インキュベー
トします。
12. アビジンとビオチンが複合体を形成するには室温で少なくとも30分かかるため、アビジン-ビオチン複合体(ABC)試薬を同時に準備してください。
13. メーカーのプロトコルに従って、必要な量のABC試薬を準備してください。
14. 0.1 M PBSでセクションを穏やかに攪拌しながら洗浄します（3 x 5分]。
15. ABC試薬を使用してRTで切片を45分間インキュベートします。
16. 0.1 M PBSでセクションを穏やかに攪拌しながら洗浄します（3 x 5分]。
17. ジアミノベンジジン(DAB)の作業溶液を準備するには、DABを含むすべてのステップをヒュームフードで行う必要があります。なぜなら、DABは発がん性があり、催奇形性があるからです。
18. プラスチック転写ピペットでDAB溶液を新しいプレートに移します。
19. DAB作業溶液を含むプレートにセクションを配置し、プレートを手でゆっくりと回転させて、セクションへの露出を最大にします。
20. 適切な信号が発生するまで顕微鏡でDAB反応を監視します（2〜5分）。
21. ティッシュを0.1 M PBS(3 x 5分)で洗浄し、希望の色強度で反応を停止してください。
22. 漂白剤を使用して、ヒュームフードに残っているDAB基質溶液を一晩中不活性化し、実験室のガイドラインに従って廃棄してください。
23. ゼラチンコーティングされたスライドにセクションをPBSで浮かせてマウントします。その後、室温で少なくとも3〜4時間乾燥させます。
24. セクションを50%、70%、95%、100%エタノールでそれぞれ2分間連続して脱水し、100%キシレンで5分間透明にします。
25. 封筒を使用して覆い、ヒュームフードに入れて一晩乾燥させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェルプレート	シグマ	CLS3524
100%エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A406-20	スライドマウント前の脱水のためのエタノール勾配を作るために使用されます。
キシレン	VWR	66004-950	有毒 - ボンネットの下で使用してください。キシレンは用途に応じて毎月交換してください。
PBS	シグマ	P3813-10PAK
トライトンX-100	シグマ	T-8787
過酸化水素	シグマ	H1009-100ML
普通ヤギ血清	アブカム	G9023-10ML
ABCキット ベクタステイン	ベクターラボラトリーズ	PK-6100	5mlのPBSに試薬Aを2滴加え、 混合し、次に試薬Bを2滴加えて混合します。
DABペルオキシダーゼ基質	ベクターラボラトリーズ	SK-4100	5 mLの二重蒸留水を加えます:2滴の緩衝液を注ぎ、混合します。DABを4滴垂らして混ぜます。過酸化水素2滴を混ぜます。
pERK抗体	Cell Signaling Technologies	4370	希釈1: 500
ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG抗体	ベクターラボラトリーズ	BA-1000	希釈1:250
SuperFrostスライド	カール・ロス	1879
カバースリップ	フィッシャー	12-548-B
DPX	シグマ	317616	スライド用封入剤.同等の封入剤をご使用いただけます。