このビデオでは、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)ベースのセンサーを使用して、器官型マウス海馬スライスの細胞内ATPレベルを測定し、生理学的および実験的条件下でニューロンとアストロサイトのATPダイナミクスをリアルタイムで可視化する方法を示します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
器官型マウス海馬スライスにおけるFRETベースセンサーを用いた細胞内ATPダイナミクスのイメージング
734 閲覧数
⸱
2025年4月28日
この記事について
要約
プロトコル
動物サンプルを含むすべての手続きは、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1.FRETベースのATPイメージング（図1）
- 実験の前に、E-ACSFを調製し、95% O2/5% CO2で少なくとも30分間泡立ててpH 7.4を得てください。蛍光灯のスイッチを入れます(キセノンlamp)モノクロメーターの(図1)。インキュベーターからスライスを取り出す直前に灌流を開始します。
注:実験全体を通して、生理食塩水を95%のO2と5%のCO2で気泡させてください。 - スライスを実験チャンバーに移し、蠕動ポンプを使用して新たにカルボジン化されたE-ACSFを常に灌流します（図1）。次に、スライスをグリッドで固定します。チャンバーを顕微鏡ステージに置き、灌流システムを接続します。灌流には、ガスプルーフの実験用チューブが推奨されます。
注:実験デザインは、室温または生理学的温度に近い温度で行うことができます。灌流の流れの安定性と信頼性を確認して、組織の動きやせん断応力の変化によって引き起こされる焦点の変化を回避します。当社や他の多くの研究室で使用されているスライス作業の標準灌流速度は、1.5〜2.5 mL/分です。 - 透過光を使用して、培養されたスライスに焦点を合わせます。実験を行う領域を特定します(例:海馬のCA1領域)。イメージング実験を開始する前に、スライスが生理食塩水条件に適応するまで少なくとも15分待ちます。実験セットアップの構成については、図 1 を参照してください。
- カメラとイメージングソフトウェアのスイッチを入れてください。次に、適切なフィルター キューブを選択します。
- ドナー蛍光タンパク質（eCFP）を435/17 nm（~435 nm）で励起します。露光時間を40〜90ミリ秒に設定します。
注：スライスが蛍光灯に強くさらされると、光毒性効果が生じる可能性があります。 - 435 nmでの励起は、475 nm(eCFP;ドナー)と527 nm(金星;アクセプター)の両方で発光します。蛍光発光を500 nmで発光イメージスプリッターで分割し、483/32および542/27でバンドパスフィルターを使用して、ドナー蛍光とアクセプター蛍光をさらに分離します。強い発現は、検出器の飽和を引き起こす可能性があります。この場合、減光フィルターを使用して励起の強度を下げることができます。
- 背景の減算のために、明らかに細胞の蛍光がない関心領域（ROI）を選択します。次に、細胞体を描写する ROI を作成します。
- 画像取得の頻度と全体の記録時間を設定します。長時間(>30分)の実験では、光毒性を防ぐために0.2〜0.5Hzの取得周波数が推奨されます。
- 録音を開始します。調製物の安定性を確保するために、ベースライン条件下で少なくとも5分間記録することをお勧めします。
注:必要に応じて、記録中にセルのフォーカスを調整してください。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
図1: FRETイメージングセットアップの設定。(A)FRETイメージングのセットアップに必要なさまざまなコンポーネントとその空間配置の概略図。キセノンランプを光源とするモノクロメーター、直立固定ステージ顕微鏡(1)、イメージスプリッターシステム(2)、タイムラプス記録用のデジタルCCDまたはCMOSカメラ(3)、安定した定灌流に対応した実験用浴(4)で構成...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-デオキシグルコース | アルファ エーザー | L07338 | 代謝不能なグルコースアナログ |
| バンドパスフィルター 483/32 | AHF Analysentechnik AG | スプリッター対応エミシオンフィルター | |
| バンドパスフィルター 542/27 | AHF Analysentechnik AG | スプリッター対応エミシオンフィルター | |
| ビームスプリッター T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | 励起ダイクロイックミラー | |
| ビームスプリッター T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | スプリッターダイクロイック | |
| データ処理 Origin Pro 9.0.0 (64ビット) | OriginLab株式会社 | 科学グラフおよびデータ分析ソフトウェア | |
| D-グルコース一水和物 | Caelo | 2580-1kg | |
| DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 |
| Eclipse E 600FN正立顕微鏡 | ニコン顕微鏡ソリューション | ||
| Eclipse FN1 正立顕微鏡 | ニコン顕微鏡ソリューション | ||
| 実験チャンバー | カスタムビルド | 生細胞イメージング用灌流チャンバー | |
| ハンクス平衡塩溶液 | シグマ・アルドリッチ | H9394 | pHモニタリング用フェノールレッド付き |
| 最小限の必須培地イーグル | シグマ・アルドリッチ | M7278 | 合成細胞培養培地 |
| モノクロメーター ポリクロームV | サーモサイエンティフィック/FEI | 超高速スイッチングモノクロメーター | |
| Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | ニコン顕微鏡ソリューション | 水浸顕微鏡対物レンズ | |
| NIS Elements 4.50 advanced Research | ニコン顕微鏡ソリューション | イメージングソフトウェア.FRETイメージング用バージョンアップ版 | |
| ORCA-Flash4.0 | 浜松ホトニクス | デジタルCMOSカメラ | |
| 灌流チューブ | Pro Liquid GmbH | タイゴンチューブ 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
| Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | 画像処理ソフトウェア | |
| ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | ATeam1.03YEMKの発現を誘導する一本鎖AAVベクトルヒトシナプシン1プロモーターフラグメントhSyn1の制御。 |
| ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | ヒトグリア線維酸性タンパク質プロモーターフラグメントABC1Dの制御下でATeam1.03YEMKの発現を誘導する一本鎖AAVベクター。 |
