マウス網膜のTwo-Photon In Vivoイメージング

要約

出典:Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、2光子顕微鏡を用いたin vivo網膜イメージングの技術を紹介しています。麻酔マウスは、頭部を固定し、眼の潤滑剤を塗布し、眼にカバースリップを貼ることでイメージングの準備をします。蛍光タンパク質を発現する網膜神経節細胞(RGC)は、まず落射蛍光を用いてアラインメントして可視化します。最後に、2光子イメージングが採用されており、RGCの高解像度の視覚化が可能です。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1。画像取得用マウスの調製

1. イメージング用麻酔マウス
   注: イソフルランへの曝露を軽減するために、適切な廃ガス清掃を確保してください。麻酔誘導チャンバーの排気ポートがパッシブ掃気ガスフィルターキャニスターに接続されていることを確認し、マウス麻酔ノーズピースの出口がガス排出装置によって提供される真空でアクティブ掃気ガスフィルターキャニスターに接続されていることを確認してください。交換用のフィルターキャニスターの重量を監視するための製造元のガイドラインに従ってください。
   1. ケタミン/キシラジンカクテルを使用してマウスに麻酔をかけます。あるいは、麻酔の維持のためにイソフルランも使用する場合は、イソフルラン吸入を介して麻酔を誘発します (イメージング セッション > 30 分)。小動物麻酔装置をセットして、0.5 L / minの流量で室内空気と混合した5%イソフルランを誘導チャンバーに充填します。マウスを誘導チャンバーに入れ、マウスが麻酔されるまで15秒待ちます。
   2. イソフルラン気化器を0%に切り替え、麻酔の流れをノーズピースに向けます。誘導室の「O₂フラッシュ」を5秒間実行します。マウスを誘導チャンバーから取り出し、ヘッドホルダーに固定してノーズピースを取り付けます。
   3. 麻酔の維持には、1%イソフルランと室温の空気を0.5L/minの流量で混合して使用します。麻酔中、5分間隔で呼吸数を監視し、イソフルランの割合を調整して、~60呼吸/分の呼吸数を維持します。
      注:これらの設定(%イソフルラン、流量)は、ケタミン/キシラジンカクテルによって誘発される麻酔の維持にも使用できます。
2. 瞳孔散大
   1. 1% w/v アトロピンと 2.5% w/v フェニレフリン塩酸塩の溶液を水で調製します。拡張器溶液は、光から保護された室温で保管してください。
   2. 使い捨てピペットの点眼器を使用して、画像化する各眼に拡張器溶液を一滴塗布します。部屋の照明を消し、瞳孔が広がるまで5分待ちます。瞳孔が拡張したら、糸くずの出ない組織で拡張器溶液を拭き取ります。
      注:拡張液が鼻孔に入らないようにしてください。
   3. 画像化される各目に潤滑剤アイジェルを大粒で塗ります。両目を画像化する場合は、脱水症状を防ぐために、非画像化目のアイジェルにプラスチックのラップフィルムを小さく貼り付けます。片方の眼のみを画像化する場合は、画像化されない目に潤滑剤の眼軟膏を塗布します。
3. イメージング用マウスの位置決め
   1. イメージングヘッドホルダーにマウスを固定するには、イヤーピースバーが水平から60°以上の角度で傾くまでヘッドホルダーのメインアームを回転させます。下部耳道ピンを内側に伸ばした位置に固定し、上部耳道ピンを引き出し位置に固定します。
   2. マウスをバイトバーに向けて、片方の耳を延長した下部ピンに取り付け、ピンを外耳道に挿入します。上耳道ピンを固定しているネジを緩め、ピンをもう一方の外耳道に伸ばします。ネジを締めてヘッドを固定します。
   3. バイトバーをマウスの頭に向かってスライドさせます。マウスの頭をゆっくりと持ち上げてから、マウスの上顎切歯をバイトバーの穴に下げます。マウスのヘッドを固定するために穏やかな力でバイトバーを引っ込め、ネジを締めてバイトバーの位置を固定します。
   4. イソフルランを使用している場合は、マウスの切歯を固定する前に、ノーズピースをスロットからバイトバーにスライドさせます。ステップ1.3.3のようにバイトバーの位置を固定して締めます。ノーズピースを上面の2本のネジで締め、マウスの鼻にぴったりと収まり、鼻が収縮しないようにします。
   5. ヘッドホルダーに入れたマウスを対物レンズの下の顕微鏡ステージに移します。目の瞳孔が光路に沿ってまっすぐ上を向くまで、ヘッドホルダーのメインアームを回転させます(図1)。
   6. #1.5カバースリップをコンパクトなフィルターホルダーに入れ、ホルダーを顕微鏡ステージに取り付けます。カバーガラスを目に向かって下げ、潤滑剤のアイジェルに接触させて、角膜のすぐ上に水平になるようにします(図1)。カバーガラスが角膜に触れないようにしてください。
      注: 顕微鏡で、励起光路が落射蛍光に設定され、発光光路が接眼レンズに設定されていることを確認します。落射蛍光イルミネーターを最低の電力でオンにし、イルミネーターのシャッターを開きます。落射蛍光イルミネーターの波長と蛍光フィルターは、イメージングする蛍光色素に対応するものをお選びください。
   7. 広視野励起光が角膜を完全に覆うまで、ステージコントロールと電動フォーカスドライブを使用して、ステージをX-Y寸法で、対物レンズをZ位置で操作します。接眼レンズを通して、網膜の蛍光細胞または構造に焦点が合うまで、ステージのZ位置を調整し続けます。サンプルシグナルの明るさが不十分で、接眼レンズを通じて目的の個々の細胞または構造を分離できない場合は、落射蛍光イルミネーターの出力を上げます。
      注:網膜の位置がわからない場合は、虹彩を固定し、網膜に向かって焦点を合わせるための高コントラストのランドマークです。このステップでは、瞳孔が最大限に拡張していることも確認できます。
   8. マウスレンズで軸上のイメージング領域を取得します。ピント面を調整するときに、ピントが合っていない光の拡大または縮小のみが発生するまで、ヘッドホルダーのさまざまな自由度を使用してマウスの角度を調整します。落射蛍光イルミネーターの電源を切り、イルミネーターのシャッターを閉じます。
      注: Z方向の焦点面をスクロールしている間に、焦点が合っていない光のX-Y視差が大きい場合は、網膜がイメージング光路に対して軸上にないことを示しています。

2. 2光子画像取得

1. 画像のセットアップと取得パラメータ
   注: 室内の照明を消し、室内の迷光光源を覆います。落射蛍光イルミネーターがオフになっていて、イルミネーターのシャッターが閉じていることを確認します。
   1. 励起光路をレーザーに、発光光路を光電子増倍管(PMT)に切り替えます。
   2. 画像取得ソフトウェアで、フレームサイズを512 x 512、フレーム平均を3に設定します。スライスあたりのステップ数を-8μmに設定します。スタックの最上位から開始して下に進むように z ステップを指定し、光受容体の 2 光子レーザー活性化を最小限に抑えます。
      注: ステップサイズを小さくしてZ分解能を上げることは可能ですが、このイメージング構成で細胞体腫を解像するには8μmステップで十分です。
   3. PMTをオンにして有効にし、PMT電圧を680Vに調整し、励起シャッターを有効にします。
      注: パワードPMTは光によるダメージを受けやすいです。落射蛍光イルミネーターがオフになっていること、顕微鏡の筐体カバーのカーテンが引かれていること、部屋の照明がオフになっていることを確認します。
   4. 1% のレーザー出力から始めて、ターゲット組織のライブ画像プレビューを開始します。ディスプレイの明るさを自動調整して、目的の細胞または構造を視覚化します。スキャンフェーズを自動調整します。ターゲット組織が暗いか不明瞭な場合は、ステップ 2.4.4 で設定した制限 (45 mW に相当) を超えずに構造が見えるまで、レーザー出力の割合を増やします。
      注: 16ビット画像の場合、対象構造を含むZ平面で明るさを自動調整したときの表示値が~1000であれば、サンプルの明るさが十分であることを示しています。
   5. 顕微鏡ステージをX-Y方向に操作して目的のイメージング領域の中心に置き、目的の構造に焦点を合わせたZ面に移動します。
      注: 視神経頭に隣接するイメージングは、慢性的なイメージング実験の明確なランドマークとして機能することを可能にします。
   6. これが慢性的なタイムラプス実験である場合は、取得コンピューターで前の画像を開き、それを参照として使用して、同じ関心領域を見つけます。イメージングの角度が以前の画像と同程度であることを確認して、視差を最小限に抑えて同じ細胞セットを取得します。
      注: 前の時点と同じセルを画像化するには (図 2 )、マウスのヘッド位置をさらに調整する必要があります。
   7. 対象の最上位と最下位の Z 面に移動してイメージング スタックの Z 境界を設定し、画像を取得します。画像取得が完了したら、PMTと発光シャッターを無効にします。発光光路を接眼レンズに戻し、励起光路を落射蛍光照明に切り替えます。マウスを顕微鏡ステージから取り外します。

結果

図1:in vivoイメージング用のマウスの位置決め。瞳孔を光路の軸上にしてマウスを配置するには、麻酔をかけたマウスを最初にヘッドホルダーに拘束し、頭を回転させて角度をつけ、潤滑剤アイジェルの大きな滴を眼に置き、マウスをステージに置きます。カバースリップは、光路に対して垂直にカバースリップホルダーに取り付けられ、目に向かって下降されます。カバーガラスが角膜やマウスの頭(左)に接触しないようにする必要がありますが、これはカバーガラスがたわんでいる場合に明らかになります。ただし、カバーガラスは、液滴のウエストを避けるために十分に近づける必要があります(右)。これはサンプルに拡大効果をもたらすためです。ゲル浸漬を適用し、カバーガラスを固定した後、ステージを顕微鏡対物レンズの真下で所定の位置に移動する必...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#1.5 coverslip	ThermoFisher	152440	Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL ガラスシリンジ	ハミルトン	80950	22G セメント針
麻酔エアポンプ	RWD ライフサイエンス	R510-30
アトロピン	Sigma	A0132	瞳孔拡張器用溶液
基本的な小動物麻酔器	RWD ライフサイエンス	R500IE
ホウケイ酸ガラスキャピ	ラリー サッター	B150-86-10	外径1.50mm、内径0.86mm、長さ10cm
CFP/YFPフィルターキューブ	Chroma	カスタム	480/40、505ロングパス、535/30
ChromoFlex - 2チャンネルPMT検出ユニット	Scientifica	S-MPLG-1002
循環ヒートポンプ	Braintree Scientific	tp-700	37°C
しがみつくフィルム	VWR	10713-916
コンパクトフィルターホルダー	ThorLabs	DH1	の目
Cx3cr1-GFP トランスジェニックマウス (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)	ジャクソン研究所	5582
DAQ コントローラーシャーシ	National Instruments	PXIe-1073
データ収集装置	National Instruments	BNC-2090A
デジタイザ付きFPGAモジュール	National Instruments	NI-5734
ガス排気装置	RWD Life Science	R546W
GenTeal 重度潤滑油アイジェル	アルコン	(地元の薬局から)	イメージング
GFP/レッドフィルターキューブ	クロマ	カスタム	535/30、560ロングパス、605/70
加熱パッド	McKesson Medical and Surgical	190147
HyperScope Launch Optics Pockels Cell	Scientifica	S-MP-101080と一緒に使用
HyperScope メインモジュール	Scientifica	S-MP-100466
HyperScope Scan Path	Scientifica	S-MP-100406
HyperScope X galvo Module	Scientifica	MP-100443
ImageJ フィジーソフトウェア		フリーウェア
イソフルラン	パターソン獣医	NDC 14043-704-06
イソフルランガスフィルターキャニスター(アクティブ清掃)	RWD Life Science	R510-31
Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging)	RWD Life Science	R510-31S
ケタミンHCl (100 mg/mL)	Vedco	NDC 50989-161-06
M32 to M26 adapter	ThorLabs	M32M26S
MaiTai GUI software	Spectra-Physics	NA
MATLAB software	MathWorks	NA	R2015b
meloxicam (5 mg/mL)	Boehringer Ingelheim	NDC 0010-6013-01	Analgesic
Micorscope Objective	Edmund Optics	46-404	Mitutoyo WE715042319
マイクロピペットプーラー	Sutter	Flaming/Brown Model P-97
Mineral oil	Fisher	BP2629-1
Mini bulldog 止血クランプ	Fine Science Tools	18053-28
ミニチュアEVAチューブ 内径0.02インチ、外径0.06インチ	マクマスターカー	1883T1
ミニチュアEVAチューブ 内径0.05インチ、外径0.09インチ	マクマスターカー	1883T4
マウスヘッドホルダー	成茂	SGM-4
No. 5 鉗子	ファインサイエンスツール	11251-10
Optic posts 1/2"	ThorLabs	TR3-P5
光パワーメーターキット	ThorLabs	PM100D
pE-300 Ultra LLG Deivery	Scientifica	COO-LED3ULLGs
フェニレフリン塩酸塩	Σ	P6126	瞳孔拡張器溶液
ポッケルスセル	Conoptics	350-80-02
ポッケルス セル増幅器	Conoptics	Model 302RM
プロパラカイン 塩酸	Σ	1571001	目の固定化
Red & Far Red ショートパスフィルター Cube	Chroma	custom	560 short pass
Rotating 1/2" post clamp	ThorLabs	SWC
ScanImageパッケージ	Vidrio Technologies	Freeware	画像取得ソフトウェア;バージョン5.4.0(2018);必要
Fresenius Kabi	NDC 63323-186-01
Stereomicroscope	Leica	S9 E
卓上遠心分離機	Oxford	Benchmate C8
テラマイシンオキシテトラサイクリン/ポリミキシンB抗生物質眼科用軟膏	Zoetisus	NA	硝子体内注射
ThermoRack 冷却システム	ソリッドステート冷却システム	ThermoRack 401	20°C
Ultrafast Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics Mai	Tai DeepSee
Vgat-Cre トランスジェニックマウス (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)	ジャクソン研究所	16962
VGlut2-Cre トランスジェニックマウス (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)	ジャクソン研究所	16963
VivoScope for In Vivo Imaging	Scientifica	S-MPVS-1200-00P
白いワセリン-鉱物油潤滑剤眼軟膏	Stye	NA	画像化後に使用
キシラジンHCl (20 mg/mL)Akorn NDC 59399-110-20

に設定 マウスの上にカバースリップをかざします中に使用用 style='height:15.75pt;'>塩化ナトリウム溶液、滅菌済み (0.9%)後に使用に設定