頭蓋骨インプラントを用いた神経免疫動態の蛍光イメージング

要約

出典:Bisht, K., et al.マウスの神経免疫ダイナミクスの反復in vivoイメージングを実行するための正確な脳マッピング。J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、頭蓋骨インプラントを移植したトランスジェニックマウスの神経免疫ダイナミクスの蛍光イメージングを示しています。血管およびニューロンの安定性は、ニューロンの活動に対する免疫応答を反映して、動的なミクログリアの変化とともに画像化されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 頭蓋窓移植のためのマウスの準備

注:蛍光タグ付きの様々なトランスジェニックマウスラインがイメージングに適しています。

1. CX3CR1GFP/+マウスを使用して、in vivoでミクログリアを視覚化します。典型的には、体重17〜25gの幼若〜若年成人の4〜10週齢のマウスが使用されます。
   注:このアプローチは離乳前のマウスにも適していますが、母親が手術後に子犬の世話をしないと、マウスを母親と一緒にケージに戻す必要があるため、回復が複雑になる可能性があります。したがって、離乳後のマウスの使用が推奨されます。
2. 麻酔室でイソフルラン(1分間の誘導のために酸素中5%の流れ)を使用してマウスに麻酔をかけます。マウスがつま先や尻尾のつま先に動きやけいれん反応を示さないことを確認します。マウスをチャンバーから取り出し、屋外で、ヘアトリマーを使用して、耳の間の頭の毛を目の高さから首のてっぺんまで徹底的に剃ります。
   注:使用されるイソフルランの濃度は、誘導チャンバーのサイズによって異なります。したがって、小さなチャンバーでは、3〜4%のイソフルランを使用して効果的に麻酔を誘発できますが、大きなチャンバーでは最大5%が必要になります。
3. マウスを定位手術ステーションのノーズコーンに移動して麻酔をかけ(手術中のメンテナンスのために1.5〜2%)、イヤーバーを使用して頭を安定させ、マウスを加熱パッドの上に置いて体温を暖かく保ちます。
4. 両目を目の軟膏で滑らかにします。100μLの0.25%ブピバカイン(マウスに局所鎮痛剤を提供し、8〜12時間持続する)と100μLの4mg / mLデキサメタゾン(手術手順から生じる可能性のある炎症を軽減するため)を切開部位に皮下注射します。.マウスを少なくとも5分間放置してから、次のステップに進みます。
5. ベタジンと70%アルコールの3つの交互の綿棒で剃った頭をきれいにします。外科用刃物またはハサミを使用して、耳の間の頭蓋骨領域の後ろから目の間の前部まで伸びる正中線の頭皮切開を行います。残りの皮膚をカットして頭蓋骨を露出させます。
6. 3%過酸化水素（H₂O₂)で画像化する脳領域を定位座標で位置特定します。
   注:頭蓋骨表面の切開部から出血がよく見られます(ステップ1.5)。この出血は通常、3〜5分以内に自然に解消します。過酸化物による洗浄が役立ちます。以前のブピバカイン治療(ステップ1.4)も、この期間中の出血量を制限することが注目されています。.

2.マウス頭蓋窓移植手術

1. 歯科用ドリルビット(先端径0.7mm)を使用して頭蓋骨に~4mmの円形の開口部を開け、先のとがった鉗子を使用して頭蓋骨のこの部分を慎重に取り除きます。6-8週齢マウスの体性感覚皮質をイメージングするには、開頭術の中心をブレグマの後方-2.5、ブレグマの外側2.0±位置に配置します。穴あけ中は、滅菌生理食塩水と綿棒で定期的に頭蓋骨を湿らせて脳を冷やし、骨の破片を取り除き、最終的に頭蓋骨を柔らかくします。
   注: 開頭術の座標は、関心領域とマウスの年齢によって異なります。
2. 頭蓋骨を取り外した後、生理食塩水で湿らせた小さなカバーガラス(サイズ#0、厚さ0.1±0.02mm)を開頭術に慎重に置きます。滅菌ワイプを使用して余分な生理食塩水を乾かします。
3. 先のとがったアプリケーター(ピペットの先端や壊れた木製の綿棒の先のとがった端など)を使用して、シアノアクリレート接着剤を窓の周りに塗布し、脳と頭蓋骨に付着させます。プライマー接着剤を頭蓋骨の残りの部分に塗布し、硬化ライトで20〜40秒間硬化させます。最終的な接着剤で窓の周りに井戸を準備し、20〜40秒の硬化ライトで硬化させます。
4. 開頭術の反対側の半球の頭蓋骨に小さなヘッドプレートを接着します 最初にプライマー接着剤をプライマーとして、次に最後の接着剤で。硬化ライトで両方をそれぞれ20〜40秒間硬化させます。
   注:この手順で頭蓋骨が接着剤で覆われている場合、縫合糸は不要です。

3.術後のケア

1. マウスを麻酔なしで目覚めさせ(加熱パッドで回復すると回復時間が短縮されます)、完全に目覚めたらマウスを自宅のケージに戻します。術後鎮痛剤としてブプレノルフィンSR(0.5mg/kg)を皮下1回注射します。これは72時間分の十分な量です。
2. 手術からの健康な回復を促進するために、マウスに水に浸して柔らかくする通常の固形チャウやゲル状の食物など、非常に柔らかい食物を与えます。
   注: 手術直後に1回限りの柔らかい食事を提供するだけで十分です。
3. 手術手順の最初の72時間について、マウスの健康状態と適切な回復を毎日監視します。その後、窓移植手術からのイメージングは、早ければ 2 週間後に行われます。
   注:うまく行えば、マウスは正常な歩行行動、十分なケージ探索、良好な水分補給、安定した体重増加、ケージ内の他のマウスやケージ内の他のアイテムとの広範な相互作用を示して、よく回復します。無気力、脱水症、および手術後の10%を超える体重減少を示すマウスは安楽死させ、研究から除外されます。

4.初期イメージングのための2光子脳マッピング

1. マウスを麻酔します(イソフルラン、5%の誘導と1.5%の維持)。35°Cの加熱プレート上に保持されている2光子顕微鏡ステージにヘッドプレートを取り付けるためのネジを使用してヘッドを安定させます。ローダミンB(2 mg / mL)などの血管色素100μLを腹腔内に注入します。
   注:イメージングは、麻酔なしで覚醒しているマウスでも行うことができます。しかし、最近の研究では、麻酔がミクログリアの監視ダイナミクスに影響を与えることが示されています。覚醒マウスの2光子イメージングのための頭部固定は、少なくとも25日間の慢性イメージング中でもストレスを増加させます。
2. 70%エタノールを軽くたたいた綿棒を使用して、頭蓋窓の表面をやさしく清掃します。頭蓋窓に数滴の水または生理食塩水を置き、対物レンズが液浸レンズであるため、対物レンズを溶液に下げます。
3. 眼鏡を通して落射蛍光で見ながら、実験室のノートに主要な血管のランドマークを示す粗い地図を手描きします。この図を使用して、2光子イメージング中の特定の領域を特定します。または、顕微鏡に取り付けられたカメラ、またはハンドヘルドカメラまたは電話を介して血管の写真を撮ります。
   注:これらの手描きの画像と写真は、2つの光子イメージングの前に顕微鏡で同じ広い領域を再訪するのを容易にするためのものです。これらは正確な画像マッピングではありません。
4. 2光子イメージングの下で、必要に応じて蛍光細胞と血管の画像を収集します。適切な座標で慎重にメモを取り、その後のイメージングで正確な領域を再確認できるようにします。この最初のイメージングセッションでは、いくつかの視野を収集します。たとえば、組織のボリュームを通じて1〜2μmごとにzスタック画像を取得します。
   注: 2つの光子で画像を収集する際には、血管のランドマークが粗いマッピングに使用されます。詳細なマッピングが必要な場合は、Thy1-YFPマウス由来のYFP標識樹状突起を使用します。
   1. イメージングには、以下の推奨パラメータを使用してください:波長880-900nmが最適です。GFPおよび/またはdsRed / Rhodamine励起には、525/50 nm(緑チャネル)および620/60 nm(赤チャネル)の発光フィルターを備えた565 nmダイクロイックミラーが使用されます。GFPとYFPの分離には、500/15および537/26nmの発光フィルターを備えた509nmのダイクロイックミラーが使用されます。脳のパワーは25mW以下に維持されます。画像解像度は1024 x 1024ピクセルで、25X 0.9 NA対物レンズ、1.5倍ズームファクターで撮影された視野は295.24 x 295.24 μmです。
5. イメージングの最後に、マウスをステージから外し、麻酔から目覚めて自宅のケージに戻るのを待ちます。

5. 2光子イメージングと再イメージング

1. }最初のイメージングセッションから数時間から数ヶ月後、マウスに麻酔をかけ(イソフルラン、5%誘導、1.5%維持)、2光子顕微鏡にマウントし、加熱プレート上に保持し、ローダミンB(2 mg / mL)などの血管色素を100 μl再注入します。
2. 以前に取得した画像をImageJで開き、これらの画像と前のセッションのメモを使用して、以前に画像化された領域を特定し、慎重に再画像化します。
3. イメージングウィンドウが明確であるか、研究の範囲にとって重要である限り、これを繰り返します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カバーガラス (3mm)	ワーナー・インスツルメンツ	64-0726
シアノアクリレート接着剤 (Krazy Glue)	アマゾン	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
デミウルトラLED硬化ライトシステム	デンタルヘルスプロダクツ株式会社	910860-1
歯科用ドリル	オサダ:www.osadausa.edu	EXL-M40
ドリルビット	ファインサイエンスツール	#19008-07
アイ軟膏	ヘンリー・シエン	1338333
iBond トータルエッチング (プライマー接着剤)	チェイスデンタルサプライ (ヘレウス・クルツァー)	66040094
ローダミンB	ミリポアシグマ	81-88-9 (R6626)
テトリス エボフロー グルー (最終接着剤)	トップデント (イボクラール ビバデント)	#595956
ウォール ブラブミニ+	アマゾン	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1