トランスジェニックマウスの横隔膜の神経筋接合部におけるカルシウム動態の蛍光イメージング

要約

出典: Heredia, D. J., et.al. マウスダイアフラムの三者シナプスにおける細胞特異的カルシウムシグナル伝達のex vivoイメージング. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオは蛍光イメージングを示しています遺伝的にコードされたカルシウム指標を発現するトランスジェニックマウスの神経筋接合部(NMJ)におけるカルシウム動態の。NJMは、横隔神経のある横隔膜の蛍光タグ付きアセチルコリン受容体によって識別されます。イメージスプリッターは、複数の信号を同時に可視化するために使用されます。電気刺激が送達され、カルシウムの流入に応じたNMJでの蛍光の変化が記録されます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手続きは、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.トランスジェニックマウスからの横隔膜と横隔神経の準備

1. これらのマウスを遺伝子型決定するために、トランスジェニックマウスとオリゴヌクレオチドプライマーを購入してください。
   1. 生後3ヶ月から6ヶ月のマウスを繁殖させ、適切なトランスジェニック/ノックインCreドライバー対立遺伝子のコピーを1つと、条件付きGCaMP3/6対立遺伝子のコピーを0個表現する同じ年齢の2番目のマウスを繁殖させます。
   2. 子犬を遺伝子型決定し、Creおよび条件付きGCaMP3/6対立遺伝子の両方を持つ子犬をマークします。これらは今後、ダブルトランスジェニックマウス(例:Myf5-Cre、条件付きGCaMP3)と呼ばれます。
      Note: このように、すべてのデータは、Cre と条件付き GCaMP3/6 対立遺伝子の両方の 1 つのコピーを発現するマウスから得られます。これは、これらの交配に他の変異マウス(例えば、ノックアウト)を追加する場合に特に重要です。
2. ダブルトランスジェニックマウスが適切な年齢(例えば、出生後0日目または5日目[P0またはP5]または成体)の場合、ハサミでマウスの首を切るか(P10未満のマウスの場合)、またはイソフルラン吸入チャンバーに入れることにより、マウスを安楽死させます。彼らが鉗子で尾をつまむことに反応しなくなったとき、彼らは犠牲の準備ができています。
3. ハサミで斬首して動物を犠牲にします。
4. 動物全体を横切って、肝臓のすぐ下、心臓と肺のすぐ上を虹彩切除ハサミで横断します。
5. 肝臓、心臓、肺を解剖し、横隔神経の長さを吸引電極に引き込むのに十分な長さ(つまり、1〜2 cm)を維持するように注意します。
   Note: 左横隔神経は、左横隔膜の内側部分に入る白い組織片として識別できます。肺を摘出する際には切ってはいけません。右横隔神経は、上大静脈も含み、大静脈よりも薄くて白い筋膜の中を走っています。一緒に、それらは両方とも右内側横隔膜を貫通します。
6. さらに、横隔膜の周りの細い隆起を除いて、胸郭と脊柱を取り除きます。
7. 横隔膜と横隔神経サンプルを、1 μg/mL 594-αBTXを含むクレブスリンガー溶液を入れたマイクロチューブに10分間、暗所で10分間入れます。
   Note: この濃度の594-αBTXは、アセチルコリン受容体(AChRs)をその機能を阻害することなく標識します(個人的な観察)。

2. 筋肉活動電位の刺激と記録

1. 微細なピンを使用して、シリコーン誘電体ゲルでコーティングし、~8 mLの酸素化クレブスリンガー溶液で満たされた6cmの皿にダイヤフラムを固定し、顕微鏡ステージに置きます。ダイアフラムをクレブスリンガー溶液(8 mL/分)で30分間灌流します。
   Note: これにより、結合していない594-αBTXがすすぎ、解剖後の組織を平衡化します。
2. 確立された方法に従って吸引電極を作成します。
   1. 4倍の倍率で、マイクロマニピュレータを使用して吸引電極を左横隔神経上に移動し、吸引電極に取り付けられたチューブに接続された5mL注射器のバレルを引き抜いて吸引を適用します。
      Note: 吸引電極にうまく引き込まれると、横隔神経は緊張します。刺激装置の電源を入れ、手動スイッチを1回回して横隔神経を刺激します。
   2. 1 Hz の刺激に反応して横隔膜が収縮することを確認するには、明視野照明で目視検査します。そうでない場合は、電圧ノブを段階的に回して電圧を調整し、筋肉の収縮を目視で確認できる超最大パルスを実現します。それでも見えない場合は、注射器で神経を吹き飛ばし、吸引を適用して再度神経を引き込むように試みます。
3. 灌流をオフにし、筋肉特異的なミオシン阻害剤BHC6または電位依存性ナトリウムチャネル拮抗薬μ-コノトキシン8を最終濃度100μMまで加えます。
   1. 100 μM BHCを作るには、DMSOに200 mMストックを4 μLピペットで入れ、1 mLのKrebs-Ringer溶液であらかじめ希釈してください。
   2. 1 mLのクレブスリンガー溶液を皿から取り出します。
   3. 希釈したBHCを皿に加えます。
      Note: このプレ希釈は、GCaMP3発現細胞における非一過性蛍光応答の原液DMSOによる誘導を防ぐのに役立ちます。
   4. 30分待ってから、新鮮なクレブスリンガー溶液の灌流をさらに20〜30分間オンにします。
4. 記録電極を準備します。
   1. 手袋を着用し、外径(OD)1mm、内径(ID)0.4mmのホウケイ酸フィラメントガラスをマイクロピペットプーラーに入れ、ダイヤルを締めて所定の位置に固定し、プーラーのドアを閉めてください。
   2. P-97プーラーを使用して、次の設定をプログラムします:900の熱、120のプル、75の速度、250の時間、500の圧力、および追加のループはありません。
      Note:抵抗(R)は、アンプのソフトウェア制御を使用して測定されます:データ収集ソフトウェアは、式V = IRを解くことによって抵抗を確認します。ソフトウェアコントローラは、既知の電流(I)(通常は1nA)を電極に流し、電圧(V)の変化を測定することで、Rを解くことができます。
   3. 初期ダイヤフラムの場合は、抵抗が60MΩ付近にあることを確認し、古いダイヤフラムの場合は10〜20MΩであることを確認してください。記録電極に3 M塩化ポサチウム(KCl)をロードします。
5. 10倍の倍率で、ステージの反対側にある2番目のマイクロマニピュレーターを刺激電極として使用して、電極を筋肉に下げます。
6. 電気生理学的データ収集ソフトウェアを使用して、静止膜電位が0から-65mV以下に変化するまで待ちます。
7. 1Hzで刺激し、適度なオーバーシュート(-65mV以下で開始すると0mVを超える電位)を示す大きな電位を確認し、筋活動電位の存在を確認します。刺激アーチファクトと活動電位を混同しないでください。
   Note: ポテンシャルは、刺激アーチファクトよりも持続時間が大幅に長くなります(~5ミリ秒)。

3. サンプルの蛍光のイメージング

1. 20倍の倍率で、緑色/黄色の光励起(550 nm)下で594-αBTX標識神経筋接合部またはNMJを探して、筋肉の中心にあるエンドプレートバンドを見つけます。画像への青色光励起(470nm)への切り替え Ca²⁺ 筋肉の反応、運動ニューロン、またはシュワン細胞。
2. 必要に応じて、バンドパスフィルターと2波長イメージング用のダイクロイックシングルエッジフィルターを備えたイメージスプリッターを設定します。
3. GCaMP3/6発現組織が示す最大蛍光(Fmax)を計算するには、ダイアフラム調製物に12 μLの3 M塩化カリウム(KCl)を添加します。
   1. ルックアップテーブルのバーを、GCaMP3/6-発現組織がKClに反応してビニングせずに20倍の倍率で彩度を示すレベルの110%に設定して実験を行います。
4. 速いイベントを見逃さないように、毎秒20フレームで録画します。
5. 吸引電極を使用して一連のインパルスを送達することにより、20 - 40 Hzの神経刺激の1 - 45秒で刺激するか、入浴または灌流によって薬理学的アゴニストを追加し、動的蛍光Ca²⁺ 静的な594-αBTX NMJ信号とともに、1つのセルサブタイプで応答します。
   Note: 組織特異的赤色または近赤色の遺伝的にコードされたカルシウムインジケーター(GECI)または遺伝的にコードされた電圧インジケーター(GEVI)マウスがNMJで使用できるようになった場合、それらを使用して、NMJで2つの異なる細胞要素を反映する2つの動的シグナルを収集することができます。
6. 所望の結果が得られてイメージング実験または電気生理学的実験が終了したら、灌流ラインを通して水を灌流し、吸引電極を通して水を2倍から3倍吸い込み、塩分が蓄積しないようにします。

材料