動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1. SRS信号検出
- 電気光学変調(EOM)
注: 20MHzのEOMは、ストークス振幅の変調に使用されます。後述するように、EOMは直交変調に必要な80MHzのレーザーパルス列から導出されます。他の変調周波数は、単色またはハイパースペクトルSRSのみを実行する場合に使用できます。その場合、変調周波数とレーザー周波数の同期は不要です。無線周波数(RF)パワーアンプを備えた周波数発生器を使用して、EOMを駆動できます。その結果、ステップ 1.1.1 から 1.1.4 をスキップできます。- ストークスのビーム経路にビームサンプラーを配置して、ビームの10%をピックアップし、高速フォトダイオードに送って80MHzのパルス列を検出します。
注: フォトダイオード信号は周波数分周器に送られ、20 MHz TTL 出力が生成されます。この出力はさらにファンアウトバッファに送られ、出力を4つの同一の20MHz出力に複製します。出力の1つは、オシロスコープをトリガするために使用されます。 - ファンアウト バッファーの出力の 1 つを取得し、バンドパス フィルターでフィルター処理して 20 MHz の正弦波を取得します。RF アッテネータを使用して、出力のピークtoピーク電圧を ~500mV に調整します。
- 結果の出力を位相シフタに送信すると、電圧源を使用してRF位相を微調整できます。この出力をRFパワーに送ります amplifierそして、の出力を接続します amplifierEOMに。
- Stokes ビームのブロックを解除し、ビーム パスにフォトダイオードを配置して EOM1 の変調深度を最適化します。EOM電圧とクォーター波長板を調整して、変調深度(バレー対ピーク比)が満足のいくものになるまで調整します。
注: 20 MHz 変調 (レーザー繰り返し周波数の 1/4) では、50 ns ごとに 2 つのパルスが予想されます。
- 時間的重なり
注: ポンプとストークスの時間的重なりは、遅延ステージに取り付けられた再帰反射板で2つのレーザーパルス列のうちの1つを遅らせることによって達成されます（図1{{TAG_91 TAG_94}}{{TAG_93 TAG_92 TAG_95}}）)。粗いオーバーラップはオシロスコープで監視し、細かいオーバーラップはSRS信号で監視します。細かい時間的オーバーラップは、利用可能な場合は自己相関器を使用しても実現できます。- ダイクロイックミラーの後にフォトダイオードを配置して、レーザービームを検出します。最初にストークスビームをブロックします。オシロスコープのポンプパルスピークの1つを拡大します。垂直カーソルを置いて、オシロスコープでこのピークの時間的位置をマークします。
- ポンプビームをブロックし、Stokesビームのブロックを解除します。遅延ステージを変換して、オシロスコープのピーク位置を前のステップでマークされた位置に時間的に一致させます。2 つのビームの時間的重なりの表示については、図 2 を参照してください。
- (オプション)遅延ステージの移動が 2 つのビームを時間的に一致させるには不十分な場合は、遅延ステージをその移動範囲の中央に移動します。
- 2 つのビーム間の時間差を取り、その差に光速を掛けて 2 つのビームを時間的に一致させるために必要な距離を見つけることにより、2 つのビームを一致させるために必要な遅延距離を計算します。
- 速いビームのビームパスを長くするか、遅いビームのビームパスを短くして、それに応じて時間遅延とほぼ一致させます。
- ジメチルスルホキシド(DMSO)と、スライドとカバースリップの間にサンプルを保持するためのスペーサーとして両面テープを使用した顕微鏡スライドサンプルを準備します。
- サンプルをカバーガラス面を顕微鏡の対物レンズに向けて顕微鏡に置きます。顕微鏡を明視野照明に交換し、接眼レンズからサンプルを観察します。まず、ガラスとテープの界面の気泡の最上層と最下層の両方で焦点を見つけ、次に焦点をテープの2つの層の間に移動させて、サンプルの焦点を見つけます。
注::接眼レンズを覗き込む前に、レーザービームがブロックされていることを確認してください。 - 調整可能なビーム出力を 798 nm に設定します。コンデンサーの光学スループットに基づいて、対物レンズの焦点でポンプビームとストークスビームの光パワーをそれぞれ~40 mWに調整します。
- MATLAB(または顕微鏡を制御する他のスキャンソフトウェア)でScanImageを開き、FOCUS とラベルされたボタンをクリックしてスキャンを開始します。
注: レーザービームはサンプルを介してラスタースキャンされ、画像が生成されます。フォトダイオードから出力された低周波信号(<100kHz)は、データ集録カードのチャンネル1(DCチャンネル)に直接送られます。フォトダイオードからの高周波出力(>100kHz)はロックインアンプに送られ、ロックインアンプ信号のX出力はデータ集録カードのチャンネル2(ACチャンネルと呼ばれる)に送られます。 - ガルボスキャナーの前にステアリングミラーを調整して、DC信号をチャネル1ディスプレイの中央に配置します。電動遅延ステージを動かし、チャンネル2(ACチャンネル)のディスプレイに表示されるロックイン出力をよく観察します。
注: ポンプとストークスの時間的一致により、ACチャンネルに信号が表示されます。ACチャンネルのカラースケールを調整して、小さな強度の変化を表示すると便利です。 - 時間遅延を微調整して、AC信号強度を最大化します。ダイクロイックミラーを調整して、SRS信号をACチャネルの中央に配置します(DCチャネルは中央に保ちます)。ロックインの位相を調整します amplifier信号を最大化するために。満足のいく信号については、図 3 を参照してください。
3. スペクトル分解能の最適化
注: サンプルに到達するポンプビームとストークスビームは、スペクトル分解能を最大化するために、同じ量の群遅延分散(GDD)を持つ必要があります。分散は実験装置に大きく依存します。ここで説明する実験装置では、1,040 nmと800 nmのフェムト秒パルスをそれぞれストークスとポンプとして利用します。パルス伸張媒体には、高密度フリントガラス棒(H-ZF52A)が使用されています。
800nmのビームパスに、48cmの高分散ガラス棒(H-ZF52Aまたは同等の高密度フリントガラス)を挿入します。EQ (1):
注: さまざまな波長のさまざまなガラス材料のGVDは、屈折率データベースリソースから見つけることができます。例えば、H-ZF52AのGVDは800nmで220.40fs2/mmです。合計 GDD は fs2 105792です。
- ポンプのGDDに一致するように、1,040 nmのビームパスに追加するために、分散ガラスロッドの何cmが必要かを計算します。適切な長さの分散ガラス棒を1,040 nmのビームパスに挿入し、800 nmビームのGDDとほぼ一致させます。なお、ガラス棒を追加すると、2本のビームの時間的な重なりが変わり、遅延の調整が必要になる場合がある。
- スペクトル分解能のキャリブレーション
- DMSOで顕微鏡スライドサンプルを作成します。スライドを顕微鏡に置き、顕微鏡コンデンサーから出るビームの力を確認します。それに応じて電力を調整して、サンプルフォーカスでそれぞれ~40 mWになるようにします。
- MATLAB から ScanImage を開きます。DMSOの2,913cm-1ラマンピークに対応する遅延ステージをスキャニングして、最大SRS信号を求めます。ロッドの挿入により光路長が増加した前のステージ位置を基準にステージ位置を推定します。ガラス棒を追加するとビームの偏差が小さくなるため、ビームの空間的なオーバーラップを再調整します。
- 電動ステージを移動させながら一連のSRS画像を順番に撮影することにより、ハイパースペクトルSRSスキャンを保存します。
NOTE: 遅延スキャン範囲は、DMSOの2,913 cm-1と2,994 cm-1のラマンピークに対応する2つのラマンピークをカバーしています。これらの2つの遷移は、800 nmのポンプと1,040 nmのストークスレーザーを使用した場合に観察されます。 - ImageJ または MATLAB を使用して、DMSO 溶液の SRS スペクトルをプロットします。大きな DMSO 2,913 cm-1 ピークを MATLAB のガウス関数またはローレンツ関数に当てはめて、ピークの半値全幅 (FWHM) を計算します。
注: 代表的な結果は図4に示されています。幅の広いピークが1つしかない場合は、スペクトル分解能が低すぎて2つのピークを区別できず、より多くのガラス棒が必要であるか、スキャン範囲が小さすぎて2番目のピークを検出できないことを意味します。通常、許容されるスペクトル分解能DMSOは、ガラス棒の長さが>60cmの場合、~20-25 cm-1です。低解像度は、組織イメージングによく使用され、より短いパルスでより高いシグナルと交換されます。
- (オプション)オートコリレータまたはFROG(周波数分解光ゲーティング)を使用して各アームのパルス持続時間を決定し、ポンプとストークス間のGDDを一致させるために必要なGDDの量とロッドの長さを正確に計算します。
- Stokesビームのロッドの長さを変えて手順3.3.2-3.3.4を繰り返し、最適なスペクトル分解能を求めます。これは、実験的に最適なGDDマッチングが見つかったことを意味します。長さの異なる複数のガラス棒セットを使用して、最適なスペクトル分解能を実現します。
4. S/N比(SNR)特性評価
- ステップ4.2は、空間的および時間的なアライメントが完了した後に実行されることを確認します。
- DMSOの2,913cm-1ラマンピークに対応するSRS画像を取得してください。ImageJで画像を開き、フレームの中央にある小さな領域を選択します。measure 関数を使用して、選択したエリアの値の平均と標準偏差を計算します。
選択したエリアの平均値を標準偏差で除算して、式 (2 のように SNR 値を求めます。
注: 両アームのフォーカスで 40 mw/40 mw の DMSO を使用したシステム (ロックイン時定数 4 μs) の良好な SNR は >800 です。データ・アクイジション・カードのビット深度が限られている場合は、低濃度のDMSOまたは低電力を使用して、SNRをより正確に推定できます。
- SNRが低すぎる場合は、レーザーパルスを再調整して、空間オーバーラップ、時間オーバーラップ、ビームサイズ/コリメーションマッチング、および/または分散マッチングを最適化します。収差補正環のある対物レンズの場合は、補正環を調整して信号を最適化します。
5. 周波数軸のキャリブレーション
注: このステップは、遅延ステージの位置をスキャンされたラマン遷移に関連付けるために実行されます。適切な「ラマン定規」を生成するには、溶媒を慎重に選択する必要があります。DMSOは、2,913 cm-1と2,994 cm-1に2つの鋭いラマンピークがあるため、CH結合に有効な溶媒です。
- DMSOの2,913 cm-1と2,994 cm-1のラマンピークをカバーする遅延ステージ範囲でハイパースペクトルスキャンを保存します。ハイパースペクトル データセットに対応するステージ位置を保存します。
注: スペクトルの全球最大ピークは DMSO 2,913 cm-1 ラマンシフトに対応し、2 番目の最大ピークは DMSO 2,994 cm-1 ラマンシフトに対応します。 - 2,913 cm-1 と 2,994 cm-1 でステージ位置とラマンシフトの線形回帰を実行します。ステージ位置をラマンシフトに関連付ける線形回帰方程式を使用して、遅延位置を対応するラマン周波数に変換します。
6. 直交変調と2色イメージング
注: 直交変調ステップは、リアルタイムの2色イメージングが必要な場合にのみ必要です。このスキームの概略図を 図 5 に示します。直交変調では、レーザー周波数の 4 分の 1 (80 MHz レーザーの場合は 20 MHz) で駆動される EOM のペアを使用し、2 つの間で 90° の位相シフトを行います。この直交変調ステップは、単色SRSイメージングまたはハイパースペクトルSRSイメージングではスキップできます。
- EOM1変調
- 偏光ビームスプリッター(PBS2)、1/4波長板(QWP2)、および2番目のEOM(EOM2)を最初のEOMの後のストークスビームパスに取り付けます。EOM2への信号入力を抜きます。信号入力をEOM1に接続し、電源を入れます。
- ストークスビーム(1,040nmに固定)を20MHz(f0/4)で変調し、ビームを最初のEOMで送信します。EOM1の傾きと位置を調整して、ビームがEOMクリスタルをまっすぐに中央に当たるようにします。
- PBS1から出る両方の偏波を2つのフォトダイオードで観察し、オシロスコープで変調を表示することにより、変調深度を監視します。
- 20 MHz 入力の QWP1、EOM1 電圧、および位相を (位相シフターを使用) 調整して、送信ビームの変調深度を 100% に近づけるように最適化します。適切な変調深度の図については、図 2B を参照してください。
- EOM2変調
- EOM1を取り外し、EOM2を差し込んでください。
- 20MHzの2番目のアンプの高電圧出力をEOM2に送信します。EOM2の傾きと位置を調整して、ビームがEOMクリスタルをまっすぐに中央に当たるようにします。
- もう一度、オシロスコープでPBS2から出る両方の偏波を見て、変調深度を監視します。必要に応じてQWP2、EOM2電圧、および位相シフタを調整して、両方の分極で100%に近い変調を実現します。
- パルス列変調が最初の変調から 90° 位相シフトしていることを確認します。
注: 2つのポンプパルス列が90°直交していない場合、2つのチャンネル間のクロストークが問題になります。 - EOM1 と EOM2 の両方をオンにして差し込むことにより、変調の直交性をテストします。PBS2によって分割される両方の偏波をオシロスコープで監視します。2 番目の PBS の後のパルス列が Figure 2C に似ていない場合は、EOM1 と EOM2 を個別に再最適化します。
- EOM2の下流に20mm複屈折水晶振動子(BRC)と半波長板(HWP)を取り付けます。両方の EOM を一度に接続し、パルス列を Figure 2D のようになるように監視します。
注: この実験で使用されたチャープでは、20 mm BRC は 80 cm-1 ラマンシフトに対応する時間遅延を誘発します。異なるチャープを使用する場合は、異なるBRC長が必要になることがあります。
- キャリブレーション
- ロックインアンプのXおよびYチャンネル出力(データアクイジションカードのチャンネル2および3に送信)からの信号を検出することにより、DMSOを使用してシステムをキャリブレーションします。
- 2,913 cm-1のピークが速い偏波と遅い偏波のピークが、ロックインアンプの位相が90°近くずれているか確認してください。そうでない場合は、2 つの信号の位相が 90° ずれるまで EOM アライメントを調整します。
- キャリブレーションが完了したら、直交ビームの1つの2,930 cm-1でタンパク質遷移をプローブする遅延位置を見つけます。もう一方の偏光が2,850 cm-1の脂質転移をプローブしていることを確認します。
7. エピモードSRSイメージング
注: 透過モードイメージング方式では、対物レンズがレーザーをサンプルに集束させ、コンデンサーレンズが透過ビームをフォトダイオードに向け、ロックイン検出を行います。エピモードイメージング方式では、サンプルによって後方散乱および脱分極された光は、集光対物レンズによって再収集され、偏光ビームスプリッターを使用して分離されます。孤立した反射光子と後方散乱光子は、ロックイン検出のために一対のリレーレンズを介してフォトダイオードに送られます。図6は、エピモードイメージングスキームを示しています。
- ビームが顕微鏡に入る前にHWPを取り付けて、顕微鏡に入るビームの偏光を変更します。対物レンズの上にPBSを配置して、脱分極後方反射ビームが検出器に到達できるようにします。
- 75 mmアクロマートレンズと30 mm非球面レンズからなるレンズのペアを使用して、対物レンズの後部開口部から後方散乱光子を光検出器に中継します。検出器を取り付けて、PBSによって指示された後方散乱光を収集します。フィルタを取り付けて、変調ビームが検出器に入るのを遮断します。
- 組織サンプルを対物レンズの下に置きます。エピモードイメージングにはコンデンサーは不要なため、スペースが必要な場合は取り外してください。
- イメージング
- はシャッターでビームを遮断します。側面からサンプルに白色光源を当てます。そして、明視野を使用して客観的な焦点を見つけます。
- 両方のビームのブロックを解除し、事前にキャリブレーションされた遅延位置を使用して、ロックインアンプの2つの出力から組織から脂質およびタンパク質SRS画像を取得します。
- ロックインゲインとピクセルビンファクターを調整して、高品質の画像を取得します。
8. 偽色染色
- ImageJで画像スタックを開きます。
- 脂質(2,850 cm-1)とタンパク質(2,930 cm-1)の種に対応する2つの画像を、画像上で右クリックしてDuplicate)の種を取り出します。
- 脂質画像の名前をlipids に、タンパク質画像の名前をproteinsに変更します。
- Process |画像計算機とタンパク質を減算します。脂質。
- Image |カラー |チャンネルを統合し、脂質 から緑 と タンパク質 から 青 に設定します。image channels ツールを開きます (Image |カラー |チャンネルツール)と明るさとコントラストの調整(Image |調整 |明るさ/コントラスト)。
- チャンネルツールを使用して、各チャンネルの明るさとコントラストを調整します。脂質チャネルについては、細胞の特徴が暗く見えるまでコントラストを調整します。タンパク質チャネルについては、細胞の特徴が青色に見えるまでコントラストを調整します。マージされたチャンネルの緑/青の画像をRGB画像に変換するには、Image |タイプ |RGB カラー です。この画像をFile |名前を付けて保存 |Tiff.
注: 偽H&E染色の場合、配色はピンク色の細胞質を示し、核は濃い青紫色を示します。 - Table of Materials にある偽の H&E 染色スクリプトリソースから HE.M MATLAB スクリプトをダウンロードします。
- MATLAB で HE.m スクリプトを実行します。前の手順でエクスポートしたRGB画像を選択して、人工的にH&E染色された画像を生成します。
- (オプション)大視野イメージングでは、画像が中央よりも周辺部で暗く見えるため、画像の強度を正規化します。
- 画像のフィールド正規化を実行するには、できるだけ多くの画像を平均化します。次に、ImageJ (Process |フィルター |ガウスぼかし |radius=50)です。
- ぼやけた画像の最大強度を測定します(Ctrl+M)。ぼやけた画像を最大強度で割ります(Process |数学 |割る)。生のSRS画像をぼやけた画像で割る (Process |画像|電卓)。
